🗊Презентация Накопительные культуры и принцип элективности. Методы выделения культур микроорганизмов.

Накопительные культуры и принцип элективности. Методы выделения культур микроорганизмов.

Культура накопительная - начальный этап получения чистой культуры микроорганизма из природных субстратов. Культура накопительная - начальный этап получения чистой культуры микроорганизма из природных субстратов. Заключается в создании элективных (избирательных) условий для роста организма определенного вида или группы сходных видов, при которых он (они) преодолевает конкуренцию других микроорганизмов. В качестве элективных факторов могут выступать – кислая реакция питательной среды. Принцип элективности разработан С. Н. Виноградским. Заключается в подборе строго избирательных условий - питательной среды и других факторов - для выделения и культивирования определенных видов микроорганизмов с учетом их природных физиологических особенностей.

Чистая культура (или аксеничная культура) — совокупность микроорганизмов одного вида, имеющие одинаковые морфологические, биохимические и культуральные свойства. Чистая культура (или аксеничная культура) — совокупность микроорганизмов одного вида, имеющие одинаковые морфологические, биохимические и культуральные свойства. Чистые культуры используются при: изучении систематики и изменчивости микроорганизмов; диагностике для идентификации возбудителей порчи пищевых продуктов; диагностике инфекционных болезней; в микробиологической промышленности в качестве исходного материала для получения ферментов, вакцин, антибиотиков, витаминов, стероидных гормонов и других продуктов; в пищевой промышленности: в виноделии, пивоварении, производстве молочнокислых продуктов и хлеба.

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты — биовары. Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу — фаговарами. Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо символами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами. Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты — биовары. Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу — фаговарами. Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо символами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами. Колония представляет собой видимое изолированное скопление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей морфологии, цвету и другим признакам.

Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований — идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизма. Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований — идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизма. Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов. Культуральные свойства характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры. Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах. При идентификации бактерий до рода и вида обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens, золотистый пигмент — Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент — Pseu-domonas aeruginosa. Для установления биовара   (хемовара, серовара,  фаготипа) проводят дополнительные исследования по выялвениб соответствующего маркера – определению фермента, антигена, чувствительности к Фанам.

Методы выделения чистых культур микроорганизмов - аэробов. Аэробы – это микроорганизмы, для жизнедеятельности которых необходим О2 воздуха. МЕТОД ПАСТЕРА (МЕТОД ПРЕДЕЛЬНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ). Заключается в том, что из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой среде (пробирки с физ. раствором по 9 мл). Посев проводят пипеткой Пастера или бак петлей. МЕТОД КОХА (МЕТОД ГЛУБИННОГО ПОСЕВА). Основан на механическом разведение микробных клеток с использованием питательных сред (пробирки с расплавленным или охлажденным агаром по 9 мл). Посев проводят пипеткой Пастера или бак петлей. МЕТОД ДРИГАЛЬСКОГО. Основан на механическом разделении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри (несколько чашек). Посев проводят пипеткой Пастера с бак петлей или шпателем. МЕТОД ИСТОЩАЮЩЕГО ШТРИХА. Делается подобно методу Дригальского, но в целях экономии сред и посуды можно пользоваться 1 чашкой Петри (разделив ее на сектора, и последовательно засевать их штрихом). МЕТОД ЗАДЕРЖКИ РОСТА. Основан на культивировании микроорганизмов на питательных средах, содержащих вещества (например, антибиотики), задерживающие рост одних микроорганизмов и не влияющие на рост других.

ТЕРМИЧЕСКИЙ МЕТОД Заключается в нагревании исследуемого материала в течение 15-20 мин при t=80°С. Это нужно для того, чтобы остались только споровые микроорганизмы, устойчивые к нагреванию. ТЕРМИЧЕСКИЙ МЕТОД Заключается в нагревании исследуемого материала в течение 15-20 мин при t=80°С. Это нужно для того, чтобы остались только споровые микроорганизмы, устойчивые к нагреванию. ХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД Выделения чистых культур ведется с помощью химических веществ, к которым они устойчивы, а др микробы не устойчивы. Например, возбудитель туберкулеза устойчив к действия кислот, спиртов и щелочей, а др микробы – нет. После воздействия кислоты или щелочи клетки туберкулезной палочки остаются живыми, а все другие микроорганизмы, содержащиеся в исследуемом материале, погибают. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД Заключается в заражении лабораторных животных (биопробе) и выделении чистой культуры. После вскрытия павшего животного из внутренних органов делают посевы на специальные среды, на которых вырастают чистые культуры выделяемых микробов. Метод используется для выделения только патогенных микроорганизмов.

Можно также использовать преимущества в некоторых физических свойствах изучаемого микроорганизма, таких, как его размеры и подвижность; это позволяет в значительной мере отделить данный организм от других в популяции. В основе действия химических методов лежит использование токсичных веществ, которые подавляют рост оставшейся части популяции, не оказывая влияния на выделяемый микроорганизм. Кроме того, это могут быть вещества, служащие источниками питания, используемыми преимущественно отдельными микроорганизмами в смешанной популяции. Биологические методы включают использование специфических хозяев для выделяемого организма, а также преимуществ некоторых патогенных свойств микроорганизма (например, его инвазивность), которыми не обладают другие представители популяции. Во многих случаях для получения максимального эффекта накопления сочетают физические, химические и биологические методы. Как правило, накопительные культуры получают в закрытых системах, т. е. микроорганизмы выращивают в обычных периодических (стационарных) условиях на чашках Петри, в колбах или пробирках, где в среде культивирования концентрация питательных веществ и продуктов метаболизма постоянно изменяется в процессе роста клеток.

Получение чистых культур Из накопительных культур микроорганизмы обычно выделяют путем их пространственного отделения от других форм на твердой среде, где они растут в виде колоний. Для микроорганизмов, не растущих на твердых средах, можно использовать метод предельного разведения, последовательно перенося клетки в отдельные пробирки с жидкой средой. Для выделения микроорганизмов в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего используют способ изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде или метод предельных разведений. Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но из их скоплений. Для выделения предпочтительнее использовать неселективную среду, поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить. Не следует очень быстро отбирать колонии, поскольку за данный отрезок времени могут не вырасти медленно растущие контаминирующие организмы.

Чистые культуры Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии, и при микроскопировании выявляются схожие клетки, в частности, по морфологии и результатам окраски по методу К. Грама. Однако возможны исключения, например, колонии, вырастающие из чистой культуры, могут быть гладкие (S) и шероховатые (Р). Кроме того, в чистых культурах различных микроорганизмов могут появиться морфологически различные клетки (полиморфизм), цисты и споры. Наконец, некоторые микроорганизмы проявляют грамвариа-бельность. Тем не менее, указанные критерии широко используются при определении чистоты культур.

Определение чистоты культуры При определении чистоты культуры учитывают морфологию колоний, формирующихся на плотных питательных средах, оценивая следующие признаки: профиль – плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т.д.; форму – округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная и т.д.; размер (диаметр) – измеряют в миллиметрах; если размеры колонии не превышают 1 мм, то их называют точечными; поверхность – гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная; блеск и прозрачность – колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная; цвет – бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная; особо отмечают выделение в субстрат пигмента;

• край – ровный, волнистый, зубчатый, лопастной, ризоидный, бахромчатый и т.д.; • структуру – однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая и т.д.; • консистенцию: колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, маслянистой, слизистой (прилипает к петле), вязкой, пленчатой (снимается целиком), быть хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей). Размеры и многие другие особенности колонии могут изменяться с возрастом и зависят от состава среды. Поэтому при их описании указывают возраст культуры, состав среды и температуру культивирования.

Рис. Культура дрожжевого гриба Candida albicans

Классификация процессов культивирования Выбор процесса культивирования зависит не только от потребностей организма, но и от того, для чего будет использована культура, то есть, от конечной цели эксперимента. 1) по состоянию питательной среды или по основной фазе (поверхностные и глубинные); 2) по наличию или отсутствию перемешивания (динамические или статические); 3) по содержанию кислорода (на аэробные или анаэробные); 4) по способу действия (закрытые, чаще периодические, и открытые, чаще непрерывные); 5) по количеству ферментеров (одно-, дву- и многостадийные); 6) по способу управления (хемостатные, турбидостатные, оксистатные, рН-статные и другие); 7) по степени защищенности от посторонней микрофлоры; 8) по числу видов микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов на твердой поверхности Культура бактерий на твердой среде имеет ряд преимуществ: 1. В случае культур, выращенных на твердой среде, нет необходимости использовать оборудование для сбора клеток, поскольку в этих культурах клетки находятся уже в сконцентрированном состоянии. 2. Твердые культуры относительно свободны от макромолекулярных компонентов и полностью свободны от частиц питательной среды, так как последние обычно находятся внутри агарового геля. Более того, твердые культуры относительно свободны от низкомолекулярных питательных веществ и продуктов метаболизма микроорганизмов. 3. На твердых средах можно получать результаты, которые невозможно достичь другим путем.

Недостатки твердых культур 1. Твердая культура имеет ограничения при выращивании больших количеств биомассы. 2. Твердые культуры не обеспечивают однородность популяции клеток, т. е. культура гетерогенна в физиологическом отношении. Гетерогенна культура и в техническом смысле, так как клетки микроорганизмов и питательная среда распределены неравномерно. 3. Твердые культуры характеризуются небольшим числом клеток в пересчете на данное количество среды.