🗊Презентация Инсулин

СРС:Инсулин

Инсулин Инсулин - пептидный гормон, выделяемый β-клетками о. Лангенгарса. Состоит из двух пептидных цепей: А-цепь - из 21 аминокислотных остатков. В-цепь содержит 30 аминокислотных остатков Эти две цепи связаны бисульфидными –S-S- связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина. При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина - проинсулин. Проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков. С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин. До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота.

Создание технологии получения субстанции инсулина человека. 1) создание штамма-продуцента инсулина; 2) создание технологии получения субстанции генно-инженерного инсулина человека(ГИЧ); 3) масштабирование процесса и создание опытно-промышленного производства активной фармацевтической субстанции (АФС) инсулина; 4) разработка методов контроля качества и создание стандарта качества (фармакопейной статьи предприятия).

Технологический процесс производства субстанции ГИЧ основан на следующей схеме: 1. Получение посевного материала штамма-продуцента (оживление консервированной культуры; выращивание маточной культуры; выращивание инокулята). 2. Биосинтез рекомбинантного белка (РБ) (выращивание продуцента в ферментере (ферментация); получение биомассы (сепарирование); дезинтеграция клеточной суспензии; выделение и отмывка телец включения (центрифугирование)). 3. Выделение и очистка РБ (солюбилизация телец включения и восстановление РБ белка; ренатурация и последующая хроматографическая очистка РБ). 4. Ферментативное расщепление РБ. 5. Хроматографическая очистка инсулина. 6. Получение кристаллов ГИЧ.

Технологическая схема получения инсулина

Технологическая схема получения инсулина

Технологическая схема получения инсулина

Приготовление посевного материала. Эталонную (музейную) культуру штамма-продуцента дважды последовательно высевали на агаризованной питательной среде. Отобранные клоны проверяли на продуктивность РБ методом электрофореза на полиакриламидном геле. Уровень накопления гибридного белка должен быть не менее 30% от суммы всех белков клетки. Далее для выращивания маточной культуры в колбу с жидкой питательной средой вносили несколько типичных колоний рабочей культуры и выдерживали при +37оС. Готовая маточная культура имела оптическую плотность при длине волны 540 нм, равную 7,5 оптическим единицам (ОЕ); рН 5,1 и типичную морфологию клеток при отсутствии посторонней микрофлоры. Инокулят, получаемый из маточной культуры, имел оптическую плотность при длине волны 540 нм, равную 4,3 ОЕ; рН 6,1 и был использован на стадии биосинтеза.  

Биосинтез РБ. Выращивание штамма-продуцента проводили в биореакторе (ферментере) объемом 200 л, содержащем питательную стерильную среду. В ферментер засевали инокулят и проводили биосинтез при температуре +37оС, рН 7,0, рО2 - 55% от насыщения и давлении в аппарате 0,25 атм. Температуру, рН, давление в аппарате поддерживали автоматически. При достижении необходимой оптической плотности культуральной жидкости культуру непрерывно подпитывали раствором глюкозы. В ходе культивирования в ферментер вносили раствор ампициллина и проводили индукцию синтеза рекомбинантного белка изопропил-β-D-тиогалактозидом (ИПТГ). Через 4-5 ч. После добавления индуктора процесс останавливали. Общее время культивирования составляло 12-13 ч. Съем сырой биомассы с 1 л культуральной жидкости – 55 г, содержание влаги – около 70%, содержание рекомбинантного белка в клетках биомассы – 25-30 %.  

Получение биомассы. Получение биомассы. Культуральную жидкость центрифугировали с помощью проточной центрифуги. Средний съем сырой биомассы – 11 кг, влажность - 72%, содержание РБ в биомассе – 27-30%.

Разрушение клеток и выделение телец включения. Подготовленную суспензию клеточной биомассы разрушали на проточном дезинтеграторе при повышенном давлении в 600 атм. за 3-4 цикла дезинтеграции. Разрушение клеток контролировали по накоплению растворимого белка, степень разрушения клеток оценивали визуально с помощью микроскопа. Степень разрушения клеток составляла 90-95%. Дезинтегрированную суспензию клеток далее подавали на вращающийся ротор проточной центрифуги. Скорость подачи не более 1 л/мин. Вес влажного осадка телец включения (ТВ), содержащих рекомбинантный белок, составлял около 3 кг (15 г/л КЖ), содержание влаги около 80%, содержание РБ около 50%.

Разработка технологии выделения и очистки субстанции инсулина. Процесс получения инсулина состоит из трех основных этапов: получения проинсулинсодержащего РБ в мономерной форме; получения ГИЧ из РБ (ферментативный гидролиз); очистки и кристаллизации цинковой соли инсулина.

Хроматографическая очистка рекомбинантного белка на анионите. Очистка РБ осуществляется на сорбенте на основе ДЕАЕ-сефарозы в одну стадию, при этом получают белок преимущественно в мономерной форме

Получение кристаллов цинк-инсулина. Раствор белка, полученного после гель-фильтрации, обрабатывали ацетатом цинка, и при рН 6,0 осаждали аморфный осадок инсулина, который растворяли в растворе лимонной кислоты и, добавляя раствор хлористого цинка на холоду, получали кристаллы цинковой соли ГИЧ. В лабораторных условиях после последовательной промывки водой для инъекций, спиртом и эфиром осадок кристаллического цинк-инсулина сушили под вакуумом в течение 48 часов. В опытно-промышленном производстве водный осадок цинковой соли ГИЧ после фильтрации под вакуумом подвергали лиофильной сушке до регламентных характеристик по специально разработанному протоколу. В результате на конечной стадии в производстве из 17 кг телец включения (1м3 культуральной жидкости) получали более 80 г ГИЧ

Способы получения инсулина 1) модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом Метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека. 2) генно-инженерным способом Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека.  

Варианты получения биотехнологического инсулина 2.1. раздельный синтез А- и В-цепей с последующим заключением между ними дисульфидных связей. осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ. Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин. 2.2. синтез проинсулина с последующим выщеплением С-_пептида. получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона. При этом конформация проинсулина обеспечивает правильное замыкание дисульфидных связей, что делает второй способ микробиологического синтеза более перспективным.

В 1975 г. У.Гилберт предложил следующую схему синтеза инсулина: В 1975 г. У.Гилберт предложил следующую схему синтеза инсулина: Из опухолевых клеток поджел. железы выделяется мРНК инсулина. С помощью обратной транскриптазы мРНК получают кДНК. Полученную кДНК встраивают в плазмиду рBR322 E. Coli в среднюю часть гена пенициллинидазы. Рекомбинантная плазмида содержит информацию о структуре проинсулина. В результате трансляции мРНК в клетках синтезируется гибридный белок, содержащий последовательности пенициллинидазы и проинсулина. Проинсулин выщепляли из данного белка трипсином. Из проинсулина выделяется инсулин.

Escherichia coli C помощью E.coli синтезированы обе цепи человеческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона. Химическим способом получают ген, программирующий биосинтез предшественника инсулина или два гена, программирующие в отдельности биосинтез цепей А и В инсулина. Следующий этап – включение гена предшественника инсулина (или гены цепей порознь) в геном E.coli – особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях. Эту задачу выполняет генная инженерия. Из E.coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью β-галактозидазы E.coli). В результате E.coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят и очистку. В бактериях синезируется около 100000 молекул инсулина на бактериальную клетку.

В Институте РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli. из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности. В Институте РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli. из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

Примеры препаратов инсулина, полученные путем генной инженерии: Хумулин Р Хумулин-цинк Хумулин-Н Инсуран Р Инсуран НПХ Инсуман Комб Генсулин М и др.

Инсулин-лекарство для умных, а не дураков. Будь то врачи или пациенты. Э. П. Джослин (США) Все препараты инсулина, выпускаемые мировыми фармацевтическими фирмами, различаются в основном по трем основным признакам : 1) по происхождению; 2) по скорости наступления эффектов и их продолжительности; 3) по способу очистки и степени чистоты препаратов

I. По происхождению различают : I. По происхождению различают : а) природные (биосинтетические), естественные, препараты инсулинов, изготавливаемые из поджелудочных желез крупного рогатого скота, например, инсулин ленте GPP, ультраленте МС а чаще свиней (например, инсулрап СПП, монотард МС, семиленте и др. ); б) синтетические или, более точно, видоспецифические, человеческие инсулины. Эти препараты получают с помощью методов генной инженерии путем ДНК-рекомбинантной технологии, а потому чаще всего их называют ДНК-рекомбинантными препаратами инсулина (актрапид НМ, хомофан, изофан НМ, хумулин, ультратард НМ, монотард НМ и др. ).

III. По скорости наступления эффектов и их продолжительности различают : а) препараты быстрого короткого действия (актрапид МС, актрапид НМ, инсулрап, хоморап 40, инсуман рапид и др. ). Начало действия этих препаратов - через 15-30 минут, длительность действия составляет 6-8 часов; б) препараты средней продолжительности действия (начало действия через 1-2 часа, общая продолжительность эффекта - 12-16 часов); - семиленте МС; - хумулин Н, хумулин ленте, хомофан; - ленте, ленте МС, монотард МС (2-4 часа и 20-24 часов соответственно); - илетин I НПХ, илетин II НПХ и др. в) препараты средней продолжительности в смеси с инсулином короткого действия: (начало действия 30 минут; длительность - от 10 до 24 часов); актрафан НМ; хумулин М-1; М-2; М-3; М-4 (продолжительность действия до 12-16 часов); инсуман комб. 15/85; 25/75; 50/50 (действует в течение 10-16 часов).

АКТРАПИД НМ, получаемый из бета-клеток островков поджелудочной железы свиньи, выпускается как официнальный препарат во флаконах по 10 мл, чаще всего с активностью по 40 ЕД в 1 мл. Вводят его парентерально, чаще всего под кожу. Этот препарат (как и все препараты подгруппы инсулинов быстрого короткого действия) оказывает быстрое сахаропонижающее действие. Эффект развивается через 15-20 минут, а пик действия отмечается через 2-4 часа. Общая продолжительность сахароснижающего влияния - 6-8 часов у взрослых, а у детей до 8-10 часов. Достоинства препаратов инсулина быстрого короткого действия (актрапида) : 1) действуют быстро; 2) дают физиологический пик концентрации в крови; 3) действуют кратковременно. Основной недостаток - кратковременность действия, что требует повторных инъекций . Показания для использования препаратов инсулина быстрого короткого действия :

Список литературы