🗊Презентация Физические методы исследования биологических объектов

Физические методы исследования биологических объектов Лекция 1

АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ ( СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ )

Предмет биофизики Взаимодействия в биологических системах разного уровня организации

Виды взаимодействий

Электромагнитные взаимодействия в биологических системах молекулах клеточных структурах тканях органах организме в целом.

Как обнаружить существование электромагнитных взаимодействий? Воздействовать на объект исследования электромагнитным излучением И Регистрировать результат с помощью физических и физико-химических методов, в том числе, спектроскопии

Спектральные методы исследования

Оптические методы исследования Спектрофотометрия: Абсорбционная спектроскопия Дифференциальная спектрофотометрия Производная спектроскопия Линейный дихроизм Круговой дихроизм Люминесцентный анализ: Флуоресцентная спектроскопия Поляризационная спектрофлуориметрия Фосфороскопия Импульсная спектрофлуориметрия Рамановская спектроскопия (спектроскопия комбинационного рассеяния) Рефрактометрия

Оптические методы исследования биологических систем биологически важными молекулами, клеточными структурами, тканями, органами, с организмом в целом.

Спектральный состав излучения Солнца Распределение энергии в спектре излучения абсолютно черного тела между волнами различной длины волны . Площадь под кривой определяет интенсивность излучения абсолютно черного тела. С увеличением температуры площадь растет пропорционально четвертой степени температуры. (Закон Стефана-Больцмана). При повышении температуры абсолютно черного тела длина волна, на которую приходится максимум излучения, уменьшается согласно закону Вина.

Характеристики светового излучения.

Свойства светового излучения

Свойства электрона

Электрон в атоме. Интерференция электронной волны.

Уравнение Шредингера

Электрон в одномерном потенциальном ящике. Пример. Расчет , Е для модельного случая – электрона в потенциальном ящике. Этот воображаемый ящик должен обладать следующими свойствами: электронная волна свободно движется в нем вдоль оси x в [0;l]; волновая функция вне интервала [0;l] =0; (0)=0; (l)=0; потенциальная энергия внутри интервала U=0; система находится в стационарном состоянии: =f(x), f(t), е обладает только кинетической энергией, которая не растрачивается.

Положим, что Положим, что Уравнение приобретает вид: Его решение находится в виде: Параметр  находим из условия: (l)=0  sinl=0  l=n   = n/l Таким образом, энергия принимает дискретные значения Каждому значению энергии соответствует своя волновая функция вида

Решение уравнения Шредингера для атомной системы позволяет найти, по крайней мере, две величины: Решение уравнения Шредингера для атомной системы позволяет найти, по крайней мере, две величины: распределение электронной плотности вокруг ядра энергию электрона в атоме.

Взаимодействие света с веществом Фотофизические процессы в молекулах

Уровни энергии в молекуле. Схема энергетических уровней. (диаграмма Яблонского)

Комбинационный принцип в спектроскопии - следствие основного квантового закона

Шкалы Е, ,  , kT Шкала энергий Е пропорциональна шкале частот  и волновых чисел  . Для атомных систем можно пользоваться шкалой абсолютных температур Т и шкалой kT, являющейяся мерой средней тепловой энергии.

Электронные переходы в молекулах Согласно принципу Паули на каждом уровне молекул могут располагаться только два электрона с противоположными спинами. Предполагается, что молекулярные орбитали являются линейной комбинацией атомных орбиталей (ЛКМО), которые при взаимодействии образуют две молекулярные орбитали – связывающую ( ) и разрыхляющую(-). Образование связывающих орбиталей является энергетически выгодным, поскольку энергия при этом уменьшается (относительно свободных атомов). Образование разрыхляющей орбитали связано с повышением энергии. Самой низкой по энергии является связывающая -орбиталь, далее следует связывающая -орбиталь. Самой высокой по энергии является разрыхляющая *-орбиталь

Например, в молекуле этилена (CH2=CH2) два атома углерода соединены одной σ и одной π связью. Поглощение фотона соответствующей энергии может привести к переходу одного из π-электронов на разрыхляющие орбитали, обозначающиеся π* . Такой переход называется π → π* (рис. 1-3). Например, в молекуле этилена (CH2=CH2) два атома углерода соединены одной σ и одной π связью. Поглощение фотона соответствующей энергии может привести к переходу одного из π-электронов на разрыхляющие орбитали, обозначающиеся π* . Такой переход называется π → π* (рис. 1-3).

Условия поглощения электромагнитного излучения. 1. Дипольное строение молекулы (Любая в целом электронейтральная система, содержащая электрические заряды, в некотором приближении (то есть собственно в дипольном приближении) может рассматриваться как электрический диполь. Дипольное приближение будет корректным, если расстояние, на котором изучается электрическое поле системы, велико по сравнению с её характерными размерами) 2. Условие резонанса (необходимое условие). Условия частот Бора: 3. Правило отбора 1. (достаточное условие). Квадрат дипольного момента перехода 4. Правило отбора 2. Суммарный спин молекулы не изменяется 5. Золотое правило Ферми

Дипольный момент перехода

Правила отбора при электронных переходах Правила отбора устанавливают, какие из квантовых переходов (как излучательных, так и безызлучательных) возможны (являются разрешенными), а какие запрещены. Они исходят из наиболее общих соображений о симметрии пространства - времени и о симметрии индивидуальной молекулярной системы. Каждое из правил отбора связано с одним из законов сохранения и симметрией. Различают строгие правила отбора, связанные, например, с сохранением при квантовых переходах полной энергии системы или полного момента количества движения и проекции полного момента на одну из координатных осей, и приближенные правила отбора, возникающие в результате введения дополнительных (приближенных) законов сохранения, обусловленных наличием каких-либо малых взаимодействий, например, спин-орбитального взаимодействия.

Правила отбора при электронных переходах

Правила отбора при электронных переходах

Закон Бугера – Ламберта – Бера I - интенсивность падающего света, I0 - интенсивность прошедшего света, l -длина кюветы, n - концентрация , молекул / м3, S – площадь сечения пучка,  – поперечное сечение поглощения одной мишени, Т – пропускание, A - коэффициент поглощения, D – оптическая плотность, с – число молей в литре (моль/л),  - молярный коэффициент экстинции (поглощения) (л/(мольсм)), равный оптической плотности 1 М раствора, измеренной при l=1см

Отклонения от закон Бугера-Ламберта-Бера Возможные причины появления отклонений: 1. Молекулы хромофоров распределены в растворе неравномерно. Занижение D тем выше, чем больше оптическая плотность частиц. 2. В формулировке закона БЛБ подразумевается, что ε является константой, не зависящей от концентрации. (Если, например, происходит агрегация молекул), то фотофизические свойства молекул, в том числе и значение ε, будут изменяться. 3. При использовании немонохроматического света зависимость D от с может отклоняться от линейной. 4. В растворе под действием измеряющего света не должны сколько-нибудь заметно протекать фотохимические превращения хромофоров. 5. При достаточно большой интенсивности в результате поглощения света концентрация невозбужденных молекул может заметно уменьшатся в ходе измерения, происходит занижение D 6. Если помимо поглощения образец рассеивает свет, то произойдет завышение D. 7. Точному измерению оптической плотности может мешать люминесценция образца. Если фотоны люминесценции будут попадать на фотодетектор, то это приведет к занижению D.

Спектры поглощения биологически важных соединений

Характеристики спектра поглощения Положение максимума – соответствует наиболее вероятной усредненной энергии электронного перехода: Е=hv Площадь под кривой поглощения – пропорциональна вероятности электронных переходов fij Амплитуда - оптическая плотность в максимуме поглощения max Полуширина полосы поглощения – интервал частот 1/2 (1/2 ) между точками на кривой поглощения, соответствующими max/2

Молярный коэффициент поглощения Молярный коэффициент поглощения, ε(λ), отражает способность молекулы поглощать свет в данном растворителе. В рамках классической теории поглощение света молекулой вещества может быть описано, если представить ее как колеблющийся диполь, который позволяет ввести величину, называемую силой осциллятора (или силы колебания), которая напрямую связана с интегралом полосы поглощения следующим образом:

Площадь под кривой поглощения

Информация из спектра поглощения Определить частоту (длину волны) поглощения Рассчитать энергии электронных переходов соответствии с формулой Определить силу осциллятора. Определить дипольную силу перехода. Рассчитать дипольный момент перехода. В соответствии с законом БЛБ рассчитать концентрацию поглощающего вещества.

Спектры поглощения органических молекул

Спектры поглощения биологически важных соединений

Спектры поглощения биологически важных соединений

Влияние растворителя на спектры поглощения

Сравнительная характеристика электронных переходов

Блок-схема однолучевого спектрофотометра

Качественный спектрофотометрический анализ Качественный спектрофотометрический анализ основывается на том, что каждое соединение имеет характерный для него спектр поглощения. Для идентификации вещества наиболее важны следующие параметры: 1) число максимумов в спектре поглощения, 2) положение (длина волны) каждого максимума; 3) значение коэффициентов поглощения в каждом из максимумов (в единицах s или ε); 4) отношение амплитуд максимумов, т. е. отношение коэффициентов поглощения в максимумах, если их несколько. Сложность спектра поглощения зависит от того, какому числу электронных переходов между разными уровнями соответствуй данный спектр. Считается, что каждый электронный переход дает полосу поглощения, которая на графике представлена кривой, близкой к гауссовой кривой нормального распределения.

Количественный спектрофотометрический анализ Количественный спектрофотометрический анализ основан на применении закона Бугера-Ламберта-Бера. При количественном анализе можно одновременно определять концентрацию нескольких веществ, если спектры их поглощения различаются по форме. Суммарный спектр поглощения DΣ нескольких веществ есть простая сумма спектров поглощения компонентов, так как при всех длинах волн оптические плотности компонентов суммируются.

Трудности при измерении спектров поглощения биологических объектов Спектр поглощения – суперпозиция кривых поглощения индивидуальных компонентов. Сильное рассеяние. Большая оптическая плотность (используется только для исследования веществ в малых концентрациях). Высокая светочувствительность. Гетерогенность образцов. Поскольку метод измерения поглощения по сути является дифференциальным (оптические свойства объекта всегда сравниваются с оптическими свойствами контрольного объекта), могут возникнуть ошибки, связанные с регистрацией и последующим сравнением этих спектров.  

Пути преодоления трудностей Использование светочувствительных приемников, фотоумножителей, интегрирующих сфер. Добавление к объекту веществ, увеличивающих показатель преломления (глюклза, глицерин) Разложение спектра на составляющие Использование информации о коэффициентах поглощения компонентов) Дифференциальная спектрофотометрия Производная абсорбционная спектроскопия

Разностная спектрофотометрия Метод регистрации спектров поглощения имеет ряд недостатков: Используется только для исследования веществ в малых концентрациях. Поскольку метод измерения поглощения по сути является дифференциальным (оптические свойства объекта всегда сравниваются с оптическими свойствами контрольного объекта), могут возникнуть ошибки, связанные с регистрацией и последующим сравнением этих спектров.

Блок-схема двухлучевого спектрофотометра

Разрешающая способность спектрофотометра. Необходимый предел разрешения Успешный анализ спектров поглощения зависит от точности регистрации спектров, а также определяется разрешающей способностью и чувствительностью спектрофотометра. Разрешающая способность оптических приборов характеризует способность этих приборов давать раздельное изображение двух близких друг к другу точек объекта. Наименьшее линейное (или угловое) расстояние между двумя точками, начиная с которого их изображения сливаются и перестают быть различимыми, называется линейным (или угловым) пределом разрешения. Обратная ему величина служит количественной мерой разрешающей способности оптического прибора.

Выбор ширины щели Выбор ширины щели определяется данными о ширине измеряемой полосы. (Экспериментально  может быть определена как полуширина полосы, полученной при записи очень узкой спектральной линии (например, эмиссионного спектра Hg или Fe).) Для практических целей, в случае полос, контур которых описывается гауссовой кривой,  должна быть в 6-7, иногда в 10 раз меньше полуширины измеряемой полосы. Пример. При измерении спектра поглощения ряда фотосинтетичесих объектов в красной и инфракрасной области =1-1,5 нм (ширина измеряемой полосы - 10-15 нм); в УФ, коротковолновой видимой и, если не требуется разрешения тонкой структуры - =3-4 нм.

Количественные критерии разрешения спектров критерий Реллея: две полосы гауссовой формы равной ширины и интенсивности считаются разрешенными, если величина провала на суммарной кривой не менее 20% их максимального значения. Согласно этому критерию установлена связь между шириной индивидуальной линии и расстоянием между максимумами в симметричном дублете при провале 50% критерий Сперроу: две полосы гауссовой формы равной ширины и интенсивности считаются разрешенными, если между кривыми лишь обнаруживается «провал». Полосы считаются разрешенными, если вторая производная суммарного спектра в максимуме равна 0. В этом случае x – полуширина индивидуальной полосы,  - расстояние между максимумами в дублете

Способы увеличения разрешающей способности спектрофотометра Помимо аппаратурных ограничений, существуют ограничения, обусловленные характером самих спектров, состоящих из близко расположенных и сильно перекрывающихся индивидуальных полос с различной интенсивностью и полушириной. Реальное увеличение разрешающей способности спектрофотометра связано с понижением температуры; с применением производной спектрофотометрии.

Производная спектрофотометрия Производная спектрофотометрия – разновидность дифференциального метода. Сущность метода – непосредственное измерение разницы оптических плотностей D1 и D2 для двух монохроматических лучей 1 и 2, разделенных спектральным интервалом . Отношение разности оптических плотностей к ширине спектрального интервала - является функцией длины волны при 0:

Достоинства метода. Достоинства метода. Спектр второй производной по форме ближе к спектру поглощения. Теоретический предел разрешения значительно увеличивается за счет сужения полос. Недостатки метода. Для более общего случая анализ не сделан. Усложняется форма кривой. Появляются «сателиты» (дополнительные провалы) на обоих склонах основных максимумов инвертированной второй производной.

Спектр поглощения суспензии Clorella

Спектры поглощения биологически важных соединений

Спектры поглощения биологически важных соединений

Спектры поглощения биологически важных соединений

Вопросы к зачету Изобразите принципиальную схему однолучевого спектрофотометра и опишите принцип его действия. В чем недостаток спектрометров данной конструкции по сравнению с двулучевыми спектрофотометрами? Изобразите принципиальную схему двулучевого спектрофотометра и опишите принцип его действия. В чем преимущество спектрометров данной конструкции по сравнению с однолучевыми спектрофотометрами? Условия поглощения электромагнитного излучения. Приведите вывод закона Бугера–Ламберта–Бера на основе теории мишени. Зависимость оптической плотности, пропускания и поглощения раствора от его концентрации. Уровни энергии в молекуле. Схема энергетических уровней(диаграмма Яблонского) Электронные переходы в молекулах Спектр поглощения. Характеристики спектра поглощения. Попытайтесь нарисовать спектры поглощения каких-нибудь известных вам соединений. В спектрах поглощения ряда биологически важных соединений положение полосы поглощения в спектре зависит от размеров системы сопряженных связей. Каким образом проявляется эта зависимость и как ее можно объяснить? Как влияет светорассеяние на измеряемые спектры поглощения? Как уменьшить и как учесть это влияние? Влияние растворителя на спектры поглощения Качественный спектрофотометрический анализ. Количественный спектрофотометрический анализ Трудности при измерении спектров поглощения биологических объектов. Пути преодоления трудностей

Вопросы к зачету