🗊Презентация Метод УФ-спектроскопии

Метод УФ-спектроскопии Лабораторная работа №8 по «Генетике микроорганизмов»

План: Теоретические основы метода УФ-спектроскопии Понятия поглощения (оптической плотности), пропускания, молярной экстинкции Обощенный закон Бугера-Ламберта-Бера Параметры спектров поглощения веществ Закон аддитивности Определение чистоты препарата и концентрации ДНК спектрофотометрическим методом

Теоретические основы Рассмотрим кювету с раствором какого-либо окрашенного вещества известной концентрации С Толщина кюветы l Пусть на кювету падает монохроматический световой луч интенсивности I0, а интенсивность луча, прошедшего через кювету и измеренного с помощью фотоприёмника, равна I

Пропускание Отношение интенсивностей прошедшего и падающего излучений называется пропусканием и обозначается Т Т=I/I0 Величина Т измеряется в долях единицы или в процентах.

Поглощение Отношение интенсивности света, поглощённого образцом (I0-I), к интенсивности падающего на кювету I0 называется поглощением: (I0-I)/ I0=1- I/I0=1-Т Как видно из определения, величины пропускания Т и поглощения (1-Т) изменяются в пределах от 0 до 1 (от 0 до 100 %)

Закон Бугера-Ламберта-Бера В общем случае поглощение (1-Т) не пропорционально концентрации вещества, поэтому для определения концентрации используют другой показатель – оптическую плотность D=lg(I/I0) Связь между оптической плотностью и концентрацией вещества описывается законом Бугера-Ламберта-Бера: D=εCl, где С – концентрация вещества, моль/л, l – толщина кюветы, см, ε – молярный коэффициент погашения (коэффициент экстинции) Из определения оптической плотности очевидно, что D=lg(1/T) Так как значения Т заключены в пределах от 1 до 0, то величина D может изменяться от 0 до 2

Коэффициент молярной экстинции Так как оптическая плотность – величина безразмерная, то коэффициент молярной экстинции будет иметь размерность л/(моль·см). Этот коэффициент и определяет поглощательную способность того или иного вида молекул и её зависимость от длины волны света, т.е. спектр поглощения ε=f(λ).

Параметры спектров поглощения

Параметры спектров поглощения

Применение метода по измеренной на спектрофотометре оптической плотности D=lg(I/I0) при известных ε и l можно определить концентрацию вещества С=D/(εl) Обычно оптическую плотность измеряют при длине волны, соответствующей максимуму поглощения. Наибольшая точность измерений достигается при оптической плотности 0,43. Точность измерения падает при слишком больших и при слишком маленьких поглощениях

Закон аддитивности

Измерение спектра поглощения ДНК Максимум поглощения ДНК λмакс приходится на длину волны около 260 нм а ε=6600, однако, индивидуальные основания имеют λмакс (в нм): 260,5 для аденина; 264,5 для тимина; 246 для гуанина и 267,0 для цитозина Соответственно ε оснований при λмакс 13,4×103 , 7,9×103 , 10,7×103 , 6,1×103

Измерение спектров биологических препаратов Неравномерное распределение вещества приводит к тому, что часть света проходит мимо частиц не поглощаясь - эффект сита увеличивает интенсивность прошедшего света I, а следовательно и светопропускание Т (D падает) Гетерогенность биологических образцов приводит к рассеянию на границах раздела фаз «среда–частица» свет не попадает на фотоприёмник вызывая кажущееся падение I (Т падает, а D возрастает) В результате максимумы сглаживаются и уширяются полосы поглощения Чтобы избежать этого, необходимо использование более тонких и гомогенных образцов, а также сред с более близкими к частицам коэффициентами преломления