🗊Презентация Микроскопия, виды и возможности современных микроскопов

Микроскопия

История Первый прибор типа микроскопа был построен около 1590 г. Нидерландскими мастерами братьями Янсенами. С 1610 г. начинается быстрое совершенствование микроскопов. Роберт ГУК (1635-1703) - Разносторонний ученый и изобретатель. В 1665 году опубликовал труд «Микрография». Рассматривая тонкий срез пробки под микроскопом, обнаружил множество мелких ячеек и назвал их "клетками".

Что такое свет?

Видимая область спектра

Imaging Techniques

Световая микроскопия

Светлопольная микроскопия

Темнопольная микроскопия

Фазово-контрастная микроскопия При прохождении пучка света через неокрашенный объект изменяется лишь фаза колебания световой волны, что не воспринимается человеческим глазом. Чтобы изображение стало контрастным, необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные. Это достигается с помощью фазово-контрастного конденсора и фазового объектива.

Фазово-контрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов. 

Флуоресцентная микроскопия

Green Fluorescent Protein (GFP)

Электронная микроскопия

Intro to Electron Microscopy Similar to optical microscopy except with electrons rather than photons Used to image samples with a resolution of 10 Å Can image many different structural geometries Mostly limited by radiation damage from the electron beam

Некоторые модели электронного микроскопа

Пропускающая и сканирующая электронная микроскопия (TEM и SEM) Transmission Electron Microscope Phase contrast Image is formed by the interference between electrons that passed through the sample and ones that did not Scanning Electron Microscope Electron beam is scanned across the sample The reemitted electrons are measured in order to form the image

Negative Staining Biological samples are often imaged using negative staining The elements of biological molecules do not interact strongly with the electron beam Instead they are seated in a material that does and then the negative space of the sample is imaged in this material

Флуоресцентная и трансмиссионная электронная микроскопия гомоцистеинилированного κ-казеина

Immunochemical Applications It is very easy to image gold clusters with EM due to gold’s properties Thus the use of gold labeled antibodies is particularly helpful in immunochemistry Labeled antibodies will bind to their antigen EM can then be used to identify the location of antibodies and by extension the antigens

Cryo-Microscopy Samples are often frozen in order to preserve the structure against radiation damage from the electron beam In order to not damage the structure when freezing, the sample is flash frozen If ice crystals were allowed to form they would damage the sample Samples are typically dunked into liquid ethane or propane (~11o K)

Конфокальная микроскопия Конфокальная микроскопия – это один из методов оптической микроскопии, который обладает существенным контрастом по сравнению с обычными классическими микроскопами. Отличительной особенностью данного метода является использование диафрагмы, способной отсекать поток фонового рассеянного света. В конфокальном микроскопе в каждый момент времени происходит регистрация изображения одной точки объекта. Полноценное изображение получается за счет сканирования передвижения образца или перестройки оптической системы. После объективной линзы расположена диафрагма небольшого размера так, чтобы свет, испускаемый исследуемой точкой, проходил через нее и регистрировался, а свет, исходящий от других точек, задерживался диафрагмой. Описанный метод исследования позволяет изучать внутреннюю структуру различных клеток. С его помощью можно идентифицировать отдельные молекулы и структуры клетки, микроорганизмы, а также динамические процессы, протекающие в клетках.

Конфокальная микроскопия возможность получать трехмерное субмикронное расширение объектов, а также значительно расширилась возможность проведения неразрушающего анализа прозрачных образцов. Благодаря использованию в указанных микроскопах в качестве источников света лазеров, достигается повышение их разрешающей способности. По сравнению с ксеновыми или ртутными лампами лазеры отличаются существенными преимуществами, так как обладают способностью монохроматичности, а также высокой параллельности испускаемого пучка света. Конфокальная микроскопия позволяет получать улучшенное разрешение вдоль оси Z. Специальные программы, которыми оснащены конфокальные микроскопы, позволяют из серии оптических срезов создавать объемные изображения объектов, а также рассматривать их под разными углами зрения. Применение мультиспектрального лазерного сканирующего конфокального микроскопа дает возможность изучать колоколизацию в клетке различных веществ. Мультиспектральный режим позволяет проводить на конфокальном микроскопе исследования по методу FISH.

Микрофотография мышиного эмбриона возрастом около десяти с половиной дней после оплодотворения. Эмбрион окрашен флуоресцентным маркером, выявляющим клетки предшественники нервной ткани, затем ткани эмбриона были обработаны так чтобы сделать их прозрачными. Изображение построено из серии плоскостных срезов, для того чтобы сделать виртуальную объемную модель эмбриона Микрофотография мышиного эмбриона возрастом около десяти с половиной дней после оплодотворения. Эмбрион окрашен флуоресцентным маркером, выявляющим клетки предшественники нервной ткани, затем ткани эмбриона были обработаны так чтобы сделать их прозрачными. Изображение построено из серии плоскостных срезов, для того чтобы сделать виртуальную объемную модель эмбриона

Атомно-силовая микроскопия Оптическая система измеряет отклонения зонда, сканирующего поверхность Между атомами зонда и образца действуют силы 10-11 – 10-6 Н (при зазоре примерно 1 Å ).

Потенциальная энергия взаимодействия атомов

Зонд атомно – силового микроскопа из углеродных нанотрубок

Суперфлуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения Нобелевская премия по химии присуждена за суперфлуоресцентную микроскопию сверхвысокого разрешения Нобелевская премия в области химии 2014 года присуждена Штефану Хеллю (Германия), Уильяму Мернеру (США) и Эрику Бетцигу (США) за вклад в развитие флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения.

Суперфлуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения W. Moerner впервые в мире смог детектировать отдельную флуоресцирующую молекулу. Это было сделано в IBM’s Almaden Research Center in San Jose, Calif. Затем, работая в University of California, San Diego Moerner открыл возможность включения и выключения по команде одного из вариантов GFP. При возбуждении светом с длиной волны 488-nm GFP выгорал и не мог быть задействован снова. Но Moerner обнаружил что облучение светом с длиной волны 405-nm реактивировало белок, и он мог снова возбуждаться светом с длиной волны 488-nm . Eric Betzig заложил основы для микроскопии одиночных молекул, разработав механизм, позволяющий как бы «включать» и «выключать» флуоресцентное свечение каждой молекулы. Такие фотовключаемые белки стали основой для PhotoActivated Localization Microscopy (PALM), разработанной в 2006 году Eric Betzig совместно с Harald Hess. Оригинальная установка было собрана прямо в жилой комнате Harald Hess.

PALM (~10–55 nm) Photoactivated localization microscopy incorporates into a sample special fluorescent proteins that can be toggled between on and off states when hit with a particular wavelength of light. This allows researchers to illuminate a subset of molecules in a sample and eliminate overlapping fluorescence that would blur details if everything in the sample was lit up at once. iPALM (interferometric PALM) provides images in 3-D.

STORM (~20–55 nm) Stochastic optical reconstruction microscopy, developed around the same time as PALM, also relies on fluorescent tags that can be switched on and off. In STORM’s case, the tags can be dyes or proteins. Using dyes may require an extra step, but they can be switched on and off more quickly and don’t burn out as fast as fluorescent proteins. Dyes can also be attached to genetic material.

STED (~30–70 nm) Stefan Hell. Разработанный им метод—STimulated Emission Depletion (STED) microscopy — имеет принципиальные отличия. При использовании STED microscopy один лазерный луч стимулирует флуоресценцию флуорохрома, тогда как другой перекрывающий его лазерный луч с тороидальным сечением выключает флуоресценции везде за исключением наноразмерного объема, позволяя при сканировании образца построить изображение с наноразмерным разрешением. Этот метод свехразрешающей флуоресцентной спектроскопии улучшает латеральное разрешение, но практически не меняет разрешение по оси Z.

STED (~30–70 nm) When a focused light beam hits a fluorescent-tagged specimen, it generates a blurry halo. With stimulated emission depletion microscopy (STED), a second laser shines a doughnut-shaped beam of light that turns off the excited molecules in the halo. This provides a sharper view that, when scanned across the sample, produces a super-resolution image. STED: R. Medda, D. Wildanger, L. Kastrup and S.W. Hell/Max Planck Institute