🗊Презентация Хроматографические методы анализа и их применение для контроля качества лекарственных средств (продолжение)

Хроматографические методы анализа и их применение для контроля качества лекарственных средств (продолжение) Лекция №6 по курсу «Анализ и контроль качества лекарственных средств»

Жидкостная хроматография метод разделения, в котором подвижная фаза представляет собой жидкость, а неподвижная – твердую или жидкую фазу (не смешивающуюся с подвижной фазой). Различают: А. колоночную (низкого и высокого давления – ВЭЖХ или ЖХВД) и планарную (ТСХ) хроматографии. Б. по полярности неподвижной/подвижной фаз и по механизму удерживания/разделения: - прямо-фазовую ЖХ (НФ – полярная, ПФ – неполярные жидкости) - обращенно-фазовую ЖХ (НФ – неполярная или среднеполярная, ПФ – полярные жидкости). - ионообменная или ионная. - эксклюзионная (гель-хроматография).

Оборудование (принципиальная схема)

Варианты проведения ЖХ 1. Изократический режим – постоянный состав ПФ в течение всего анализа (разделение родственных веществ, мало отличающихся по полярности). 2. Градиентный режим – изменяется состав ПФ (линейный градиент – с постоянной скоростью и нелинейный градиент – изменение состава с переменной скоростью) – для разделения веществ, отличающихся по полярности (например, смесей водо- и жирорастворимых витаминов), для повышения эффективности разделения.

Хроматографические колонки Стальные трубки внутренним диаметром 2-5 мм, длиной 5-30 см, с пористыми фильтрами с обоих концов. Для защиты аналитической колонки используются сменные предколонки (длиной 1-2 см).

Неподвижные фазы Общие требования: 1. Для обеспечения высокой эффективности разделения – размер частиц сорбента должен быть четко установленного размера (1,8 – 10 мкм), четко сферической формы. 2. Должен быть устойчивым к повышенному давлению (нехрупким), к химическим веществам (устойчивость при рН 2-8) и температуре (до 60-80оС). 3. Обладать высокой удельной поверхностью (60-300 м2/г) и определенным размером пор (10-300 нм). 4. Обратимая сорбция разделенных соединений.

Неподвижные фазы Классификация: 1. Полярные фазы (для прямофазной ЖХ) – немодифицированные силикагели, аминопропилсилилсиликагели, диольные производные силилсиликагеля, иониты (HILIC)

Выбор подвижной фазы для нормально-фазовой хроматографии

Неподвижные фазы 2. Среднеполярные фазы (для обращенно-фазовой ЖХ) – химически модифицированные силикагели с привитыми цианопропильными (СN), пентафторбензильными (PFP), фенильными (Ph), фенил-гексильными группами.

Неподвижные фазы 3. Неполярные фазы (для обращенно-фазовой ЖХ) – химически модифицированные силикагели с привитыми октильными (С8), октадецильными (С18), фенильными и октадецильными (С18-Ph), и др.

Принципы разделения 1. Полярные фазы – 1.1. для разделения неполярных и малополярных веществ (слабо адсорбируются НФ) – малополярные элюенты (гексан (гептан) + низкая доля полярного растворителя, дихлорметан + низкая доля полярного растворителя). 1.2. для разделения полярных веществ (сильно адсорбируются НФ) – высокая доля полярных растворителей (метанол, ацетонитрил, вода), необходимо устанавливать рН (от 2 до 9), добавлять буферный раствор (ионная сила).

Принципы разделения 2. Средне- и неполярные фазы: 2.1. Для разделения неполярных веществ используются ПФ с высоким (40-100%) содержанием органического растворителя (ацетонитрил, метанол, тетрагидрофуран). 2.2. Для разделения ионизируемых органических веществ (кислот, оснований, амфолитов, ионов) необходимо использовать буферные растворы (рН 2-8 или для ряда колонок – 1-10). 2.3. Для разделения органических ионов и сильнополярных веществ – прибавляют ион-парные реагенты (алкилсульфонаты, четвертичные аммониевые соли).

Механизмы удерживания

Закономерности удерживания в обращенно-фазовой ВЭЖХ Вытеснительная модель удерживания: 1. Из ПФ на поверхности неполярного/среднеполярного сорбента адсорбируется органический компонент (метанол, ацетонитрил). 2. При введении органического вещества оно вытесняет с поверхности сорбента часть молекул органического модификатора. Данный процесс обратимый и при движении новой порции ПФ органический модификатор вновь вытесняет сорбат.

Влияние рН ПФ и температуры На неполярных фазах за счет дисперсионных взаимодействий лучше удерживаются неионизированные молекулы. При ионизации молекул удерживание при прочих равных условиях уменьшается. Температура незначительно влияет на удерживание органических молекул в водно-органических фазах. При повышении температуры уменьшается вязкость ПФ и давление на колонке (возможно работать на более высоких скоростях ПФ).

Детекторы в ЖХ 1. Детектор спектрофотометрический (область длин волн – УФ 190-360 нм (дейтериевая лампа), видимая – 360-900 нм – галогеновая лампа) – работает при фиксированных длинах волн (от 1 до 10 и более) – двумерная хроматография.

2. Детектор на основе диодной матрицы – сканирование оптической плотности элюата в заданном диапазоне длин волн с большой скоростью (трехмерная хроматограмма – время-длина волны-сигнал детектора – е.о.п.). 2. Детектор на основе диодной матрицы – сканирование оптической плотности элюата в заданном диапазоне длин волн с большой скоростью (трехмерная хроматограмма – время-длина волны-сигнал детектора – е.о.п.).

СФ-детектор Детектор на основе диодной матрицы

Флуориметрический детектор Селективный детектор, основанный на измерении интенсивности флуоресценции разделенных веществ (устанавливаются длины волн возбуждения и эмиссии (испускания)).

Рефрактометрический детектор Основан на измерении величины преломления света элюата (универсальный детектор)

Электрометрические детекторы 1. Амперометрический детектор (детекция органических веществ, обладающих ОВ-свойствами) – может быть комплексный с ферментативными реакциями. 2. Кондуктометический детектор (детекция ионов, основанная на измерении проводимости подвижной фазы). 3. Кулонометрический детектор.

Масс-спектрометрическое детектирование Универсальный (полный ионный ток) и селективный (сканирование индивидуальных масс ионов) детектор

Масс-спектрометрическое детектирование 1. Ионизация образца (ПФ + разделенные вещества) Принципы: 1.1. электрораспылительная (ESI)

Примеры ионизации

Масс-спектрометрическое детектирование 1.2. Химическая ионизация при атмосферном давлении:

1.3.MALDI (ионизация лазерной десорбцией при взаимодействии с матрицей)

MALDI-TOF (ионизация лазерной десорбцией при взаимодействии с матрицей и времяпролетным детектированием)

Масс-анализаторы А. непрерывные масс-анализаторы 1. Магнитный и электростатический секторный масс-анализатор (Sector) 2. Квадрупольный масс-анализатор (Quadrupole mass analyzer) Б. импульсные масс-анализаторы 1. Времяпролётный масс-анализатор (Time-of-flight mass spectrometry) 2. Ионная ловушка (Ion trap) 3. Квадрупольная линейная ловушка (Quadrupole ion trap) 4. Масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (Fourier transform ion cyclotron resonance) 5. Орбитрэп (Orbitrap)

Масс-спектрометрическое детектирование Достоинства: 1. Высочайшая чувствительность органических веществ, биополимеров (10-15 г/пробе). 2. Высокая специфичность детекции (последовательная масс-спектрометрия (дочерних ионов)). 3. Метод сбора информации о структуре молекул (точность установления молярных масс – до 0,0001-0,000001 а.е.м.). 4. Широкий линейный диапазон – 106-107. 5. Наличие баз данных по масс-спектрам огромного числа органических веществ (для ГХ/МС). 6. Основной детектор при проведении биоэквивалентных испытаний, допинг-контроля, судебно-химической экспертизы, исследования метаболизма, генеза БАВ и др. Недостатки: 1. Сложность и высокая стоимость оборудования и расходных материалов. 2. Необходимо дополнительное обучение непосредственно масс-спектрометрии и интерпретации спектров.

Сравнение различных типов детекторов

Применение ВЭЖХ в фармацевтическом анализе 1. Идентификация веществ 1.1. Сравнение времен удерживания со стандартным веществом

Применение ВЭЖХ в фармацевтическом анализе 1.2. Идентификация по времена удерживания и спектрам поглощения пиков.

Применение ВЭЖХ в фармацевтическом анализе 1.3. Идентификация веществ (образцов) по хроматографическому профилю (наличие определенного числа пиков с относительными временами удерживания по любому из компонентов) – растительные экстракты, ЛС сложного состава.

Применение ВЭЖХ в фармацевтическом анализе 2. Определение специфических (родственных) примесей – полуколичественный анализ 2.1. По стандартному образцу примеси

2. Определение специфических (родственных) примесей – полуколичественный анализ 2.2. По стандартному раствору основного вещества, разведенному до определенного предела (0,05-5%).

2. Определение специфических (родственных) примесей – полуколичественный анализ 2.3. Методом внутренней нормализации

Определение специфических (родственных) примесей 2.4. Количественное определение (например, токсичные примеси) – методом градуировочного графика

2.5. Определение энантиомерной чистоты

Применение ВЭЖХ в фармацевтическом анализе 3. Определение основных показателей готовых лекарственных средств – однородность дозированных единиц, тест «Растворение», количественное определение стабилизаторов, консервантов, красителей и др. 4. Определение пластификаторов в упаковочных материалах. 5. Определение остаточных количеств пестицидов (гербицидов, инсектицидов) в ЛРС, продуктах из ЛРС. 6. Определение остаточных количеств активных фармацевтических ингредиентов на оборудовании (контроль отмывки оборудования), в сточных водах.

Капиллярный электрофорез Метод капиллярного электрофореза (КЭ) основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля за счёт подачи высокого напряжения к концам капилляра. Наиболее распространёнными вариантами метода КЭ являются: 1 капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) 2. мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ). КЗЭ - метод разделения, реализуемый в капиллярах и основанный на различии в электрокинетических подвижностях заряженных частиц как в водных, так и в неводных электролитах.

Капиллярный электрофорез МЭКХ - вариант капиллярного электрофореза, который позволяет проводить разделение соединений ионного и нейтрального характера при использовании ПАВ. Разделение электро-нейтральных соединений осуществляется благодаря введению в состав ведущего электролита поверхностно-активных веществ  - мицеллообразователей. Чаще всего используют анионный ПАВ (например, ДДС) в концентрациях, превышающих критическую концентрацию мицелообразования, что приводит к формированию так называемой «псевдостационарной фазы», и аналиты распределяются между мицеллой и буферным электролитом согласно их гидрофобности.

После подачи к концам капилляра высокого напряжения (до 30 кВ), компоненты смеси начинают двигаться по капилляру с разной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда и величины ионного радиуса и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой, при этом качественной характеристикой вещества является параметр удерживания (время миграции), а количественной – высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества. После подачи к концам капилляра высокого напряжения (до 30 кВ), компоненты смеси начинают двигаться по капилляру с разной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда и величины ионного радиуса и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой, при этом качественной характеристикой вещества является параметр удерживания (время миграции), а количественной – высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества.

Основные параметры КЭ 1. Время миграции (tм) - время, необходимое компоненту для прохождения им эффективной длины капилляра (Lэфф) от зоны ввода пробы (начала капилляра) до зоны детектирования; 2. Электроосмотический поток (ЭОП) - течение жидкости в капилляре под действием приложенного электрического поля. Время, необходимое жидкости для преодоления эффективной длины капилляра вследствие возникающего ЭОП, называют временем ЭОП (tэоп) и экспериментально определяют из электрофореграммы по времени миграции нейтрального компонента – маркера ЭОП. 3. Подвижность ЭОП (μэоп) - представляет собой отношение скорости ЭОП к напряженности электрического поля. Скорость ЭОП положительна при направлении движения жидкости от входного участка капилляра к детектору и отрицательна при обратном направлении. В свою очередь, скорость ЭОП вычисляют по формуле: νэоп=  Lэфф / tэоп.

Механизм ЭОП

Электроосмотический поток Уникальной особенностью ЭОП является плоский профиль потока в капилляре. Такой профиль выгоден, поскольку уменьшается размывание зон разделяемых веществ. Следует отметить, что эффективность разделения в капиллярном электрофорезе прямо пропорциональна, а время анализа – обратно пропорционально напряжению, приложенному к электродам. Разделение в КЭ может быть выполнено как с положительной, так и отрицательной полярностью электродов. Зная значения рКа для компонентов пробы, можно выбрать буфер с подходящим значением рН и полярность электродов, чтобы образец двигался в сторону детектора. Скорость миграции зависит от напряженности электрического поля, которая обычно составляет 200-400 В/см.

Капилляры для разделения Подавляющее большинство разделений в КЭ проводят с использованием кварцевых капилляров имеющих внешнее полимерное покрытие, обычно - полиимидное, улучшающее их механическую прочность, и значительно реже полимерные капилляры, например из тефлона. Внутренний диаметр капилляров колеблется в пределах от 25 до 200 микрон, а длина капилляра в зависимости от поставленной задачи – от нескольких сантиметров до 1 метра. Поскольку внешнее полиимидное покрытие непрозрачно в УФ-области, то участок покрытия удаляют и создают окно для УФ-детектирования. Капилляр закрепляется в специальной пластиковой кассете. Надежное термостатирование капилляра является основным условием получения воспроизводимых времен миграции определяемого соединения и площади результирующего пика, что важно для количественного анализа. Используют капилляры с внутренним диаметром 25-50 мкм, что является компромиссным решением между достаточно высокой чувствительностью и эффективностью разделения.

Ввод образца Проба может быть введена в капилляр электрофоретическим, электрокинетическим или вытеснительным способом. Объем вводимой пробы не превышает 2 нл, относительное стандартное отклонение составляет 0,03-0,04. При электрофоретическом вводе пробы, к концам капилляра прикладывается высокое напряжение на фиксированный промежуток времени, при этом входной конец капилляра погружают в раствор пробы. Ионы пробы перемещаются в капилляр пропорционально их электрофоретической подвижности. В случае электрокинетического ввода, компоненты пробы попадают в капилляр за счет комбинации электроэндоосмотического давления и электрофоретической подвижности. Вытеснительный ввод пробы достигается либо за счет создания избыточного внешнего давления инертного газа, приложенного к резервуару с образцом, либо за счет создания вакуума на выходе из капилляра или путем изменения уровня/высоты резервуара, содержащего образец, относительно резервуара с буферным раствором на выходе из капилляра (так называемое гравитационное введение пробы).

Детектирование

Пример разделения неорганических ионов (КЭ) 1 – хлорид; 2 – нитрит; 3 – сульфат; 4 – нитрат; 5 – фторид; 6 – гидрофосфат; 7 – гидрокарбонат;

Термические методы анализа Основаны на установлении зависимостей различных физических или физико-химических свойств веществ от температуры (градиента температуры). А – Термогравиметрия Б – Дифференциальный термический анализ В – Дифференциальная сканирующая калориметрия

БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!