🗊Презентация Электрофорез. Иммунотипирование в капиллярном электрофорезе

Электрофорез - направленное перемещение ионов в электропроводящем растворе под действием внешнего электрического поля - заряженные частицы перемещаются к аноду или катоду в зависимости от заряда - после начала электрофореза скорость движения сначала увеличивается, пока не уравновесит силу трения, затем частицы продолжают двигаться с постоянной скоростью

Размеры молекул простых и сложных белков, нуклеиновых кислот в растворе по своим размерам соответствуют коллоидным частицам Несут определенный электрический заряд за счет групп, способных к диссоциации Заряд белка зависит от - аминокислотного состава - других групп, способных к диссоциации - рН среды (изменяя, можно обеспечить положительный или отрицательный заряд определенной величины)

Факторы, определяющие электрофоретическую подвижность белков Величина заряда Размер белковой молекулы Форма белковой молекулы (чем менее шарообразна, тем больше тормозится движение молекулы) При электрофорезе выделяется тепло – снижается вязкость – увеличивается электрофоретическая подвижность (но и усиление диффузии и размывание зон)

Факторы, определяющие электрофоретическую подвижность белков Для стабилизации зон используют: - в жидкой среде – использование градиента плотности - введение в среду твердых носителей (поддерживающая среда). Носители имеют пористую или волокнистую структуру, увеличивается разрешающая способность электрофореза. Упрощается визуализация образовавшихся фракций

Факторы, определяющие электрофоретическую подвижность белков Недостаток – носители имеют полярные группы (целлюлоза – карбоксильные, агар – сульфогруппы и др.) Они связывают гидроксильные ионы, содержащиеся в буферном растворе. Поверхность носителя приобретает отрицательный заряд, а в растворе накапливаются положительно заряженные ионы. При подключении постоянного тока эти ионы начинают двигаться к катоду, создавая поток жидкости. Такое перемещение электролита в противоположном электрическому току - эндоосмос)

Электрофорез белков плазмы крови При добавлении к среде NaCl ионы Na+ взаимодействуют с отрицательно заряженными группами белка, уменьшается суммарный отрицательный заряд, снижается скорость его движения к аноду – улучшается разделение белковых фракций. Высокоразрешающий электрофорез проводят в буферных системах с большой ионной силой

Факторы, определяющие электрофоретическую подвижность белков

Виды электрофореза Электрофорез с подвижной границей – разделение идет в жидкой среде в U-образной кювете. Исследуемый образец помещается в нижнюю часть, одно колено заполняют буферным раствором. Под действием электрического поля заряженные частицы смещаются в сторону противоположно заряженного электрода. О скорости миграции судят по перемещению границы. Результаты фиксируются оптической системой Из-за диффузии границы зон нечеткие

Виды электрофореза Зональный электрофорез в поддерживающей среде – обеспечивает стабильность зон, используется непрерывная буферная система. В оба электродных сосуда вносится один буферный раствор Снижается влияние диффузии и конвекции Проводят на природных (ацетатцеллюлоза, крахмал, агар, агароза) и синтетических носителях Носители имеют структуру -волокнистую (целлюлоза) -пористую (ацетатцеллюлоза, гели) Носители готовятся в виде -пленок (ацетатцеллюлоза) -порошка (полиамид) -блоков (крахмал, агар, агароза, полиакриламид)

На электрофоретическую подвижность влияют адсорбция молекул исследуемого вещества на поверхности раздела фаз Присутствие ионогенных групп в носителях (целлюлоза – карбоксильные, агар – сульфогруппы, стекло – силанольные). Появление обратного тока электролита (электроэндоосмос) и удержание на поверхности носителя некоторого количества разделяемых молекул Испарение электролита – изменение ионной силы и рН буферного раствора Торможение движения молекул в волокнистых и пористых материалах

Зональный электрофорез на бумаге Специальная бумага пропитывается буферным раствором, наносится образец и подключается ток За ходом электрофореза наблюдают с помощью окрашенного вещества После электрофореза бумагу высушивают и окрашивают

Зональный электрофорез на бумаге Недостатки метода: - неоднородность по структуре - при волокнистой структуре частицы движутся как в капиллярах (торможение движения) - содержит отрицательно заряженные карбоксильные группы, имеющие отрицательный заряд - испарение жидкости с поверхности вызывает дополнительный поток электролита. Повышается его ионная сила Метод имеет историческое значение, используются другие носители

Зональный электрофорез на ацетатцеллюлозе Пленки имеют однородную структуру Диаметр пор –несколько микрон Не содержат ионогенных групп Низкая сорбция белков Может использоваться иммуноэлектрофореза

Камера для электрофореза для ацетатцеллюлозной пленке

Зональный электрофорез на ацетатцеллюлозе

Фракции белков сыворотки крови при электрофорезе на ацетатцеллюлозе

Приборы для электрофореза для ацетатцеллюлозной пленке

Аппарат для электрофореза

Электрофорез в гранулированных материалах Зональный электрофорез в крахмальном геле - сложность приготовления крахмального геля - нестабильность состава геля - недостаточно высокая скорость диффузии - крупные молекулы белков (Ig M, ЛП) или асимметричные молекулы (фибриноген) не проникают в крахмальный гель

Электрофорез в гранулированных материалах Зональный электрофорез в геле агара и агарозы - электрофорез идет как в жидкой среде, но меньше свободная диффузия - размер пор зависит от концентрации агара и агарозы (1% - поры велики, и могут мигрировать даже крупные молекулы, 2% - нет эффекта молекулярного сита). - агар содержит отрицательно заряженные группы - растворяются при нагревании, застывают при t < 40º с образовании прозрачной пленки - при разделении сывороточных белков получается 8-11 полос - используя высокоочищенную агарозу, высокую ионную силу буфера получают электрофорез с высоким разрешением - хорошо сочетается с иммунопроявлением и иммунофиксацией

Электрофорез в гранулированных материалах Электрофорез в полиакриламидном геле Синтетический материал с капиллярной структурой Размеры пор могут быть сопоставимы с размерами белковых молекул Подвижность молекул находится в обратной зависимости от среднего размера пор в геле – разделение происходит не только по заряду, но и по размеру. Гель прозрачен, механически прочен, химически устойчив и инертен Можно использовать в широком диапазоне рН, ионной силы, температуры

Электрофорез в полиакриламидном геле Варианты : - в однородной буферной системе - в неоднородной (прерывистой) буферной системе - с градиентом пористости - изоэлектрическое фокусирование - изотахофорез - двухмерный электрофорез

Диск-электрофорез Используется неоднородная разделяющая система – образуются зоны, имеющие форму диска Разделение белков проводится в геле с различным размером пор, применяются буферы с разным значением рН – создается прерывистый градиент электрического потенциала и рН

Диск-электрофорез

Диск-электрофорез в полиариламидном геле

Тест-набор для электрофореза

Диск-электрофорез Количественная оценка фракций проводится денситометрически

Капиллярный электрофорез В качестве камеры используется тонкостенный кварцевый капилляр (внутренний диаметр <100 мкм) Высокое напряжение электрического поля Продолжительность разделения – 5-30 мин

Миграция белков при капиллярном электрофорезе Разделение происходит за счет движения под действием электрического поля и тока жидкости, образующейся в результате эндоосмоса и направленной в противоположном направлении Стенка капилляра имеет отрицательный заряд, буфер заряжен положительно

Оборудование, предназначенное для разделения образцов анализируемой смеси на компоненты, посредством взаимодействия пробы с электрическим полем внутри тонкого кварцевого капилляра. Оборудование, предназначенное для разделения образцов анализируемой смеси на компоненты, посредством взаимодействия пробы с электрическим полем внутри тонкого кварцевого капилляра. Электрическое поле образуется с помощью подачи высокого напряжения на электролитный буфер и обеспечивает движение ионов. Движение избыточного количества катионов создает электроосмотический поток

Результаты разделения и идентификации белков с использованием капиллярного электрофореза

Стационарный электрофорез Через некоторое время после начала разделения макромолекул достигается распределение компонентов смеси, и ширина зон в дальнейшем не изменяется Изоэлектрическое фокусирование Изотахофорез

Изоэлектрическое фокусирование Метод разделения веществ, обладающих амфотерными свойствами, в соответствии с значением их изоэлектрической точки в среде с градиентом рН. Молекулы белков мигрируют в градиенте рН, пока не достигнут положения где заряд = 0. В результате молекулы, имеющие одинаковые ИЭТ, концентрируются в узкой зоне Используются амфолиты с определенным диапазоном рН. Ионы амфолита перемещаются до того места, где рН соответствует их ИЭТ Градиент рН можно получить: При наслоении буферных растворов с различными значениями рн - За счет создания градиента температуры

Метод разделения макромолекул, основанный на их миграции в градиенте значений рН под действием постоянного электрического поля. pI- изоэлектрическая точка, в которой белок имеет общий заряд равный нулю Белки могут распадаться имея разницу всего лишь в несколько сотых единицы-pH IEF не требователен к нанесению образца в ограниченный участок для оптимального разделения Возможность нанесения разведенных образцов многократно Концентрация образца предельно низкая в сравнении с другими электрофоретическими методами Нет денатурации белков, которая может препятствовать последующим действиям, таким как окрашивание или иммунопреципитации

Изоэлектрическое фокусирование

Изотахофорез Метод электрофореза, при котором молекулы под действием электрического поля разделяются в соответствии с зарядами, образуя узкие зоны, которые затем движутся с одинаковой скоростью, располагаясь друг за другом в соответствии с величиной подвижности каждой зоны. Наблюдается автоматическое повышение резкости границ между зонами (эффект Кольрауша) Можно проводить в свободном электролите, на полосках из ацетатцеллюлозы, в ПААГ Разрешающая способность сопоставима с диск-электрофорезом или изоэлектрофокусированием

Оценка электрофореграмм Окрашивание специфическими красителями с последующей фотометрией Регистрация поглощения УФ-лучей и флуоресценции Иммунохимические методы Регистрация радиоактивности предварительно меченных молекул

Окрашивание Окрашиваются бумага, ацетат целлюлозы, агар, агароза, ПААГ Красители образуют комплексы с молекулами, но вымываются из среды Одновременно с окрашиванием проводится фиксация Оценка – с помощью денситометрического сканирования. Измеряется интенсивность прошедшего или отраженного света, результат регистрируется в виде кривой

Современный гелевый электрофорез

Выявление по поглощению УФ-света и флуоресценции Регистрация поглощенного УФ света, проходящего через электрофореграммы на твердых прозрачных носителях Оптимальная длина волны для белковых фракций 280 нм Экстинкция зависит от содержания в белках тир и три Чувствительность метода до 1 мкг белка Облучение белков УФ светом (280 нм) вызывает их флуоресценцию, измерение проводят при 340 нм Чувствительность 0,5 мкг белка

Иммунопроявление и иммунофиксация Взаимодействие белков (антигенов) с со специфическими к ним антителами вызывает образование преципитата Иммуноэлектрофорез – комбинация простого электрофореза в геле и последующей иммунодиффузии Позволяет обнаруживать индивидуальные белки

Регистрация радиоактивности Увеличивает чувствительность метода Предварительно молекулы метятся радиоактивной меткой Радиоактивность обнаруживается при сканировании высушинных гелей с помощью счетчика

Типичные ошибки Ошибка при расчете объема исследуемого образца – избыточное количество приводит к искажению электрофореграммы Сыворотка крови содержит белки, отличающие по содержанию в десятки раз Избыточная концентрация белка искажает результаты

Типичные ошибки Ошибки при подготовке образцов для исследования – если использована плазма, а не сыворотка крови – появление дополнительной фракции между β- и γ-глобулинами при исследовании гемолизированной сыворотки – усиление β-фракции учитывать применение некоторых лекарственных препаратов. Электрофоретическая подвижность альбумина, связанного с лекарственным препаратом может отличаться от обычной

Типичные ошибки Свойства буферных растворов при близости рН к ИЭТ миграция замедлена повторное использование буфера может привести к изменению рН при хранении – изменение рН из-за жизнедеятельности микроорганизмов неправильно подобранная ионная сила (чрезмерно высокая ионная сила приводит к замедлению миграции

Типичные ошибки Ошибки, связанные с электрической цепью отсутствие напряжения – отсутствие миграции неправильная полярность – миграция в противоположную сторону перепады напряжения - искажение электрофоретической картины недостаточно высокое напряжение – слишком медленная миграция слишком высокое напряжение - искажение электрофореграммы

Типичные ошибки при электрофорезе белков

Типичные ошибки при электрофорезе белков

Роль электрофоретического анализа Определение типа электрофореграммы может подтвердить предполагаемый диагноз, выявить скрытую патологию, следить за ходом лечения Абсолютным показанием для исследования электрофореграммы является подозрение на миеломную болезнь, иммунодефицит. Может быть полезным -для диагностики заболеваний печени, нефротического синдрома, злокачественных новообразований, коллагенозов - при контроле течения заболеваний, при которых нарушается белковый состав сыворотки крови - при скрининге врожденного или приобретенного дефицита или аномалии белков - при снижении содержания общего белка < 60 г/л или повышении > 85 г/л, при снижении концентрации альбумина <35 г/л и при увеличении СОЭ > 25 мм/час

IgG 

Методические подходы к определению белков

Электрофоретические фракции и индивидуальные белки сыворотки крови здорового человека

Электрофоретические фракции и составляющие их белки сыворотки крови

Фракции белков сыворотки крови

Электрофореграмма при бисальбуминемии Выявляется двойная полоса в зоне альбумина Может быть генетически обусловленной или транзиторной Причины: присутствие препарата, связанного с альбумином, заболевания поджелудочной железы (лизис ферментами)

Электрофореграмма при анальбуминемии

Электрофореграмма при ожогах

Электрофореграмма при дефиците α1 -антитрипсина

Электрофореграмма при остром воспалительном синдроме

Электрофореграмма сыворотки крови при нефротическом синдроме Снижение α2 –глобулинов Нарушение питания Патология печени Внутрисосудистый гемолиз Увеличение α2 –глобулинов (преимущественно за счет гаптоглобина и α2-макроглобулина) Воспаление (сочетается с увеличением α1-глобулинов) Нефротический синдром

Электрофореграмма сыворотки крови и гипертрансферинемией при анемии Уменьшение β-глобулинов -патология печени -дефицит С3-компонента комплемента Увеличение β-глобулинов Увеличение β-глобулинов -Гемолизированная сыворотка ЖДА (за счет трасферрина) повышение С3-компонента комплемента

Электрофореграма сыворотки крови при алкогольном циррозе Слияние β- и γ-фракции (за счет увеличения поликлонального Ig A)

Электрофореграмма сыворотки крови при гипогаммаглобулинемии Физиологическая – у новорожденных Первичный гуморальный иммунодефицит Вторичный – при лечении глюкокортикоидами, иммунодепрессантами, химиотерапии, радиотерапии

Электрофореграмма сыворотки криви при поликлональной гипергаммаглобулинемии Диффузное усиление зоны γ-глобулинов (инфекционные заболевания печени, СПИД, аутоиммунные заболевания)

Электрофореграмма сыворотки крови при олигоклональной гипергаммаглобулинемии Появление нескольких полос (синтез в организме одновременно нескольких типов антител к различным антигенам) Накопление антител при системных ревматических заболеваниях

Электрофореграмма сыворотки крови пожилого пациента с моноклональным компонентом Появление узкой гомогенной полосы У пожилых лиц обнаруживается бессимптомная гаммапатия Встречается миеломе, лимфоме, хроническом лимфолейкозе, болезни Вальденстрема

Электрофореграмма сыворотки крови с дополнительной полосой , обусловленной присутствием фибриногена, и того же образца после обработки тромбином Появление дополнительной полосы может в присутствии фибриногена (необходимо повторное проведение электрофореза после обработки тромбином)

Определение фракций белков в моче (примеры) Определение фракций белков в моче должно проводиться после концентрирования и обессоливания образца Метод валидирован проф. Mussap, Genoa ITALY.

Определение фракций белков в моче (примеры)