🗊Презентация 29455437_lektsiya_3._klinicheskaya_enzimologii

Лекции: ЭНЗИМОЛОГИЯ Дисциплина: биохимия (Б1.Б.15) Специальность: педиатрия (31.05.02) НГМУ, кафедра медицинской химии Д.б.н., доцент Суменкова Дина Валерьевна

ЛЕКЦИЯ № 3 КЛИНИЧЕСКАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ, или ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ В МЕДИЦИНЕ

Актуальность темы Широкое использование ферментов в медицинской практике – диагностике и терапии, - диктует необходимость изучения клинических аспектов энзимологии

План лекции Применение ферментов как реагентов в диагностике заболеваний Применение ферментов в качестве лекарственных препаратов (энзимотерапия) Исследование активности ферментов для диагностики заболеваний (энзимодиагностика) Дополнительные вопросы клинической энзимологии: Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов Энзимопатии

Цель лекции Знать: пути использования ферментов в медицинской практике (примеры) ферменты, используемые в энзимодиагностике, и сущность катализируемых ими химических реакций На основе полученных знаний формируется умение трактовать данные энзимологических исследований сыворотки крови детей и подростков(биохимический анализ крови)

Ферменты как реагенты ПРИМЕРЫ: Глюкозооксидаза грибов (аэробная дегидрогеназа ) – FAD-содержащий специфический фермент для определения глюкозы в моче и крови Используется в глюкозооксидазных биосенсорах

Ферменты как реагенты Определение лактата в крови для оценки тяжести шока, гипоксических состояний, сахарного диабета с помощью лактатоксидазы и пероксидазы Лактат + O2 → пируват + Н2О2 Н2О2 + 4-аминоантипирин + фенол → окрашенный комплекс (интенсивность окраски пропорциональна содержанию лактата)

Ферменты как реагенты Рестриктазы бактерий (специфические эндонуклеазы) используются для исследования генома, например, в пренатальном скрининге наследственных заболеваний Taq-полимераза термофилов (Thermus aquaticus) необходима для проведения ПЦР-анализа в диагностике наследственных и инфекционных заболеваний, определении родства, судебной медицине

Энзимотерапия Применение ферментов (гидролазы) в качестве лекарственных препаратов Заместительная терапия – использование ферментов в случае их недостаточности ПРИМЕРЫ: лечение желудочно-кишечных заболеваний, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков Препараты панкреатических ферментов трипсина, амилазы, липазы: энзистал, мезим форте, фестал, панкреатин, пензитал

Энзимотерапия Комплексная терапия – применение ферментов в качестве дополнительного терапевтического средства ПРИМЕРЫ: фитогидролазы: бромелаин, папаин (широкая субстратная специфичность, широкий диапазон рН)– пищеварение, косметология, рассасывание тромбов, активация иммунитета, удаление «сшивок» между биополимерами

Энзимотерапия коллагеназа (преп. коллализин)- рассасывание спаек и рубцов (фиброзных процессов) после ожогов и операций гиалуронидаза (преп. лидаза)- лечение фиброзных процессов, увеличение проницаемости тканей для анестетиков

Энзимотерапия трипсин, химотрипсин – лечение гнойно-некротических ран, эмфиземы легких, бронхита фибринолизин (плазмин)– разрушение тромба при тромбозах РНК-аза и ДНК-аза – противовирусное и антибактериальное действие (аденовирусный конъюктивит, герпетический кератит)

Энзимотерапия аспарагиназа, глутаминаза – лечение лейкозов Лейкозные клетки не способны синтезировать асн и глн – аминокислоты, содержащие амидные группы, поэтому получают их из крови. Гидролитическое дезаминирвание данных аминокислот с образованием аспартата и глутамата ограничивает опухолевые клетки в незаменимых для них аминокислотах, что и приводит к нарушению роста опухоли

Трудности энзимотерапии нестабильность ферментов антигенные свойства трудности доставки к пораженным органам ПРИМЕР: действие фибринолизина не является строго специфичным (только для белка фибрина – основы тромба), он может повреждать факторы свертывания крови, вызывая геморрагический диатез Пути решения проблем Направленный транспорт ферментов Использование иммобилизованных ферментов

Иммобилизованные ферменты Иммобилизация (лат. immobilis – неподвижный) – связывание молекул ферментов с носителем Преимущества: устойчивость, нерастворимость в воде, пролонгированное действие, возможность многократного использования Носитель: полимер (целлюлоза, сефароза, агароза, полиакриламид) Способы иммобилизации: образование ковалентных и нековалентных связей с носителем полимеризация носителя в присутствии фермента инкапсулирование (например, включение в липосому)

Использование иммобилизованных ферментов: примеры Иммобилизация протеолитических ферментов на целлюлозе: повязки, тампоны для обработки и лечения ран (см. слайд 12, повязка с трипсином на диальдегидцеллюлозе) Иммобилизация ферментов на колонках для экстракорпоральной перфузии крови типа «искусственная почка», «искусственная печень»

Энзимодиагностика Постановка диагноза на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека Используются ферменты, которые по месту «работы» делят на 3 группы: СЕКРЕТОРНЫЕ ЭКСКРЕТОРНЫЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ

Секреторные ферменты Секреторные ферменты синтезируются в печени «работают» в крови (субстрат фермента находится в крови) активность в крови выше, чем в ткани Характеризуют белок-синтезирующую функцию печени: снижение активности свидетельствует о патологии печени, на фоне которой нарушается синтез белков ПРИМЕРЫ: псевдохолинэстераза (ПХЭ) проферменты свертывающей системы крови (факторы свертывания крови)

Экскреторные ферменты Экскреторные ферменты синтезируются в экзокринных железах «работают» в полости органов активность в крови незначительная и обусловлена диффузией фермента Активность в крови повышается при остром воспалении железы и, как следствие, затруднении оттока секрета в полость органа ПРИМЕРЫ: щелочная фосфатаза печени (маркер синдрома холестаза, например, при желчнокаменной болезни) амилаза и липаза поджелудочной железы (маркеры острого панкреатита)

Внутриклеточные ферменты: Внутриклеточные ферменты: цитоплазматические: лактатдегидрогеназа (ЛДГ), аланин (аспартат) аминотрансфераза (АЛТ, АСТ), креатинкиназа (КК) митохондриальные: АСТ лизосомные: кислая фосфатаза Активность в ткани высокая Активность в крови незначительная и является следствием нормально идущих процессов разрушения клеток (например, эритроцитов), повышенной проницаемости мембран в детском возрасте, выполнения тяжелой физической работы (повышение активности креатинкиназы) Значительное повышение активности в крови – признак патологии (воспаление, цитолиз, некроз) Незначительное повышение в крови цитозольных ферментов свидетельствует о воспалительном процессе, их резкое повышение – о цитолизе Повышение в крови митохондриальных или ядерных ферментов – результат некроза

«Требования» к ферментам энзимодиагностики Органоспецифичность (тканеспецифичность) фермента или его изоформ: преимущественная или абсолютная локализация в определенных органах ПРИМЕРЫ: панкреатическая липаза печеночная гистидаза и аргиназа ЛДГ1 и ЛДГ2 кардиомиоцитов неспецифические ферменты АЛТ и АСТ присутствуют во многих органах, но основным источником повышения их активности в крови являются патологии печени и сердца Количество высвобождаемого в кровь фермента должно быть пропорционально степени повреждения ткани и достаточно для определения его активности Стабильная активность ферментов в течение достаточно длительного времени (сутки)

Изоферменты Множественные формы одного олигомерного фермента (имеющего IV структуру), обусловленные различными комбинациями разных по структуре субъединиц катализируют одну и ту же реакцию Различия изоформ физико-химические свойства (так как разная I структура, М.м., заряд) органоспецифичность субстратная специфичность активность способы регуляции, чувствительность к ингибиторам и активаторам

Пример изоферментов

Изоформы в диагностике заболеваний Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) пируват + NADH+Н+ ↔ лактат + NAD+ Охарактеризуйте положение фермента в классификаторе! Внутриклеточный фермент Диагностика патологии сердца, печени, мышц Олигомерный белок: 4 субъединицы двух типов М (англ. muscle – мышца) Н (англ. heart – сердце) Назовите возможные комбинации субъединиц, образующие 5 изоформ, и предположите органы их преимущественной локализации!

Лактатдегидрогеназа 1 и 2 – сердечные изоформы Лактатдегидрогеназа 1 и 2 – сердечные изоформы Специфичность ЛДГ 1 и 2 выше к лактату, чем к пирувату, т.е. данные изоформы катализируют реакцию «лактат → пируват» при поступлении лактата из крови, где его постоянным источником являются эритроциты. Таким образом лактат используется кардиомиоцитами как источник энергии (АТФ образуется при дальнейшем катаболизме пирувата). Реакция «пируват → лактат» протекает при анаэробном гликолизе. Так как в кардиомиоцитах гликолиз преимущественно аэробный, активность ЛДГ других изоформ невысокая. Определение активности ЛДГ 1 и 2 используют в диагностике инфаркта миокарда на более поздних сроках после болевого приступа (через 2-3 суток), а также в динамике восстановления: чем быстрее нормализуется активность фермента, тем лучше.

Изоформы в диагностике заболеваний Креатинкиназа (КК) креатин + АТФ ↔ креатинфосфат + АДФ Охарактеризуйте положение фермента в классификаторе! Креатинфосфат – энергетический субстрат в мышечной и нервной тканях Внутриклеточный фермент Олигомерный белок: димер из субъединиц 2-х типов М (англ. muscle – мышца) В (англ. brain – мозг) Назовите возможные комбинации субъединиц, образующие 3 изоформы и предположите орган их преимущественной локализации!

КК-ММ (скелетная мышца) – диагностика повреждений скелетных мышц КК-ММ (скелетная мышца) – диагностика повреждений скелетных мышц КК-МВ (сердечная мышца) – диагностика инфаркта миокарда КК-ВВ (головной мозг) – не проникает через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах (не имеет диагностического значения)

Почему важно определять изоферментный состав, а не просто суммарную активность фермента? Суммарная активность фермента не предоставляет информации о локализации патологического процесса. Так, например, суммарная активность ЛДГ может быть повышена при патологиях различных органов. А в некоторых случаях суммарная активность фермента не предоставляет информации даже о наличии патологического процесса. ПРИМЕР: болезнь Тея-Сакса (ганглиозидоз) Причина: нарушение синтеза α-субъединиц гексозоаминидазы → снижение активности изоформы А Изоформа А (2α2β) Изоформа В (4β) Суммарная активность фермента при данной патологии оказывается нормальной (за счет компенсаторного повышения синтеза субъединицы β и, как следствие, повышенной концентрации изоформы В)

Основные ферменты энзимодиагностики патологии сердца, сопровождающейся цитолизом и некрозом (инфаркт миокарда) Повышается активность внутриклеточных ферментов в крови: КК-МВ (креатинкиназа, изоформа МВ) АСТ (аспартатаминотрансфераза) АЛТ (аланинаминотрансфераза) АСТ / АЛТ – коэффициент де Ритиса (в норме 1,33±0,42) Коэффициент де Ритиса повышен за счет преимущественного повышения активности АСТ (митохондриальной формы) ЛДГ 1 и ЛДГ2 (лактатдегидрогеназа, изоформы 1 и 2)

Динамика изменения активности ферментов энзимодиагностики инфаркта миокарда

Динамика изменения активности АСТ и АЛТ при инфаркте миокарда

Основные ферменты энзимодиагностики патологии печени Воспаление, цитолиз, некроз (гепатит, цирроз) Повышается активность внутриклеточных ферментов в крови: АЛТ, АСТ Коэффициент де Ритиса при вирусном гепатите < 1 за счет преимущественного повышения цитозольного АЛТ вследствие цитолиза при сохранении целостности внутриклеточных органоидов Коэффициент де Ритиса при циррозе ≈ 1 на фоне высокой активности обоих ферментов за счет «выхода» АСТ из разрушенных митохондрий ЛДГ 4, ЛДГ 5

Динамика изменения активности АЛТ и АСТ при вирусном гепатите

Основные ферменты энзимодиагностики патологии печени Синдром холестаза Повышается активность экскреторного фермента печени в крови – ЩФ (печеночной изоформы щелочной фофатазы – гидролазы фосфоэфирных связей) Повышается активность ГГТ, или ГГТП (гамма-глутамил трансферазы, или транспептидазы) – фермента цитоплазматической мембраны клеток различных органов, участвующего в транспорте аминокислот в клетку. Причина повышения активности ГГТ при холестазе – отщепление фермента от ЦПМ под действием желчных кислот. ГГТ является также маркёром алкогольной болезни печени.

Основные ферменты энзимодиагностики острого панкреатита Повышается активность экскреторных ферментов в крови: Амилаза (диастаза мочи) Липаза

Дополнительные вопросы клинической энзимологии Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов Энзимопатии

Использование ингибиторов ферментов Ингибиторы протеаз в терапии острых панкреатитов (контрикал, трасилол, пантрипин и др.)

Использование ингибиторов ферментов Ингибиторы протеаз в терапии HCV инфекции - новый класс препаратов для лечения гепатита С Действие препаратов направлено непосредственно на вирус гепатита: они подавляют или блокируют ключевые внутриклеточные этапы размножения вируса В настоящее время одобрено использование препаратов: симепревир (Россия), телапревир (Incivek) и боцепревир (Victrelis) (США, страны ЕС). Их применение в составе комбинированной терапии существенно повышает эффективность лечения пациентов.

Использование ингибиторов ферментов Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента – лечение гипертонии (берлиприл, вазолонг и др.) Ингибиторы ксантиноксидазы – лечение падагры (аллопуринол) Ингибиторы ферментов синтеза нуклеотидов и нуклеиновых кислот – лечение бактериальных, вирусных инфекций, онкологических заболеваний, например ингибиторы обратной транскриптазы – лечение ВИЧ-инфекции

Энзимопатии Патологические процессы, основанные на нарушении ферментативного катализа по причине мутации генов ферментов или нарушения экспрессии (синтеза фермента) первичные (наследственные) нарушается образование конечного продукта ПРИМЕР: Альбинизм нарушение синтеза меланина из-за дефекта тирозиназы накапливаются токсические метаболиты ПРИМЕР: Фенилкетонурия снижение образование тирозина из фенилаланина из-за недостатка фенилаланингидроксилазы приводит к накоплению фенилпирувата и фенилацетата → токсическое действие на мозг нарушение транспорта тир в мозг → снижение синтеза дофамина, норадреналина вторичные (приобретенные)

Задание № 1 для самостоятельной работы В современной клинической лабораторной диагностике широко используется метод иммуноферментного анализа (ИФА). Используя интернет-ресурсы, изучите информацию о данном методе и составьте конспект по вопросам: 1. Принцип метода ИФА. 2. Роль ферментов как реагентов в ИФА-диагностике. 3. Значение ИФА в диагностике заболеваний.

Задание № 2 для самостоятельной работы Используя интернет-ресурсы, заполните таблицу «Ферменты энзимодиагностики» и определите класс фермента

ВОПРОСЫ ДЛЯ РАЗМЫШЛЕНИЯ ВОПРОСЫ ДЛЯ РАЗМЫШЛЕНИЯ Почему активность аминотрансфераз у детей раннего возраста выше, чем у взрослых? Почему активность псевдохолинэстеразы у детей раннего возраста ниже, чем у взрослых? Почему активность щелочной фосфатазы костной ткани у детей, выше чем у взрослых?

Заключение Ферменты используются в диагностике заболеваний как специфические реагенты Препараты ферментов используются в заместительной и комплексной терапии Определение активности ферментов – важный этап диагностики заболеваний, а также контроля эффективности проводимой терапии В основе многих наследственных заболеваний лежит нарушение ферментативного катализа

Литература Биохимия: учебник для вузов / ред. Е. С. Северин. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. -768 с. Биологическая химия с упражнениями и задачами: учебник / ред. С.Е. Северин. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. -624 с. (С. 99-103) Биологическая химия: учебник для студентов медицинских вузов / А.Я. Николаев. – М.: Мед. информ. агенство, 2007. – 568 с. Клиническая биохимия: электронное учебное издание / Новосиб. гос.мед.ун-т; сост. И. В. Пикалов [и др.]. - Новосибирск: Центр очно-заочного образования ГОУ ВПО НГМУ Росздрава, 2008