🗊Презентация БИОТЕХНОЛОГИЯ Гормональных препаратов

БИОТЕХНОЛОГИЯ Гормональных препаратов

и н с у л и н

Ферменты гликолиза: 1 — Гексокиназа 2 — Глюкозо-6-фосфатизомераза 3 — 6-Фосфофруктокиназа 4 — Альдолаза 5 — Триозофосфатизомераза 6 — Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа 7 — Фосфоглицераткиназа 8 — Фосфоглицеромутаза 9 — Eнолаза 10 — Пируваткиназа Ферменты гликолиза: 1 — Гексокиназа 2 — Глюкозо-6-фосфатизомераза 3 — 6-Фосфофруктокиназа 4 — Альдолаза 5 — Триозофосфатизомераза 6 — Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа 7 — Фосфоглицераткиназа 8 — Фосфоглицеромутаза 9 — Eнолаза 10 — Пируваткиназа

Человеческий инсулин Инсулин это полипептид с м.м. 5808; - 51 аминокислота - 2 полипептидные цепи, соединенные дисульфидными мостиками: цепь А - 21 аминокислота цепь Б – 30 аминокислот Аминокислотный состав цепей видоспецифичен

Синтез инсулина в клетках поджелудочной железы

МОНОМЕРЫ инсулина МОНОМЕРЫ инсулина

биоСинтез человеческого инсулина Ι. Замещение 1 аминокислоты в молекуле свиного инсулина ΙΙ. Синтез ɑ- и β-цепей инсулина в клетках E. Coli с последующим соединением их в молекулу гормона (Великобритания) ΙΙΙ. Синтез проинсулина в клетках E. Coli с последующим преобразованием в инсулин (РАН ИБОХ)

Преобразование инсулина свиней в инсулин человека

Микробиологический синтез инсулина: Химическим путем создают синтетический ген проинсулина. На N-конце гена - кодон ТAС (метионин), а на С-конце - два стоп-кодона (терминатор). Ген присоединяют к фрагменту гена β-галактозидазы Е. coli в С-кон-цевой части. Образующийся гибридный ген имеет свой промотор и свой рибо-сом-связывающий участок Встраивают в плазмиду ВpR322 с помощью ДНК-лигазы Гибридный ген трансформируют в клетку-хозяина Выделяют и культивируют транс-формированные клетки Проинсулин, в составе β-галакто-зидазного гибридного белка выделяют и подвергают химико-ферментативной трансформации в той же последователь-ности, что и in vivo: отщепляют β-галактозидазный фрагмент, проводят окислительный сульфитолиз с последующим восстановительным замыканием 3-х дисульфидных связей Ферментативно (эндопептидаза) вычленяют связывающий центральный пептид C.

Очистка синтетического инсулина Важно очистить инсулин проинсулина, который индуцируют выработку антиинсулиновых антител. Используется хроматографическая очистка: Ионообменная, Гелевая ВЭЖХ. Наиболее эффективна аффинная хроматография

Стандартизация инсулина По чистоте классифицируют препараты инсулина на 4 группы, в зависимости от содержания проинсулина: обычные, содержат проинсулин более 1% монопиковые – менее 0,3% (Гельфильтрационная хроматография) улучшенные монопиковые – менее 0,005% монокомпонентные – менее 0,001% Полный контроль производства генноинженерного инсулина включает: контроль стабильности рекомбинантного штамма и плазмиды, отсутствие постороннего генетического материала в препарате, идентичность экспрессируемого гена и т.д., всего 22 показателя.

Соматотропный гормон

Обратитмся к литературе. И на сей раз к приключенческой. Но вовсе не замысловатый сюжет повести Еремея Парнова «Ларец Марии Медичи» привлек наше внимание к ней. Дело здесь в ином, во вполне банальной жизненной ситуации, в которой по воле автора оказываются главные герои. Их, как и положено, двое — он и она, Вера Фабиановна и Лев Минеевич. Она — высокая, властная и по сей день замечательно красивая старуха, он — маленький, пухленький старичок с детскими ручонками. И тот и другой не раз и не два задумывались на склоне лет, почему же, собственно, так и не соединились их судьбы? Обратитмся к литературе. И на сей раз к приключенческой. Но вовсе не замысловатый сюжет повести Еремея Парнова «Ларец Марии Медичи» привлек наше внимание к ней. Дело здесь в ином, во вполне банальной жизненной ситуации, в которой по воле автора оказываются главные герои. Их, как и положено, двое — он и она, Вера Фабиановна и Лев Минеевич. Она — высокая, властная и по сей день замечательно красивая старуха, он — маленький, пухленький старичок с детскими ручонками. И тот и другой не раз и не два задумывались на склоне лет, почему же, собственно, так и не соединились их судьбы? А виной тому была так, безделица, совсем пустячок — маленький рост Льва Минеевича. Стоит ли дальше рассуждать по этому поводу? Или и так всем все понятно?

Структура гормона передней доли гипофиза (СТГ), Структура гормона передней доли гипофиза (СТГ),

СОМАТОТРОПНЫЙ ГОРМОН (стг) Состоит из 191 амк. Регулирует рост человека, применяется и для лечения ожогов, переломов, язв. 1963 – получали из трупного материала, всего 4-6 мг соматотропина из 1 трупа. Этого количества катастрофически не хватало. Кроме того были частыми явления заражения гипофизарного материала нейротоксическим вирусом с очень длительным инкубационным периодом. Этот вирус нередко приводил к летальному исходу реципиентов гормона трупного происхождения. В 1985 г. ВОЗ запретила применение СТГ, выделяемого из трупных человеческих гипофизов. В 1980 г. фирмой «Genentech» получен рекомбинантный СТГ – соматрем. Отличается более высокой активностью от искусственно получаемого гипофизарного ввиду более высокой степени очистки.

Схема экспрессии чужеродных генов довольно проста, но на практике возникают следующие проблемы. Схема экспрессии чужеродных генов довольно проста, но на практике возникают следующие проблемы. Регуляторные сигналы эукариот сильно отличаются от регуляторных сигналов бактерий и не узнаются бактериальными РНК-полимеразами и рибосомами. При клонировании в бактериях ДНК эукариотической клетки экспрессия не происходит, поскольку в бактериальной клетке отсутствует система "сплайсинга". Поэтому для осуществления экспрессии эукариотического гена соответствующая кДНК присоединяется в составе векторной молекулы к регуляторным элементам бактерии - промотору и рибосом-связывающему участку. Присоединение ведется таким образом, что кодирующая часть эукариотического гена присоединяется к кодирующей части бактериального гена так, чтобы сохранялась "рамка" считывания. В этом случае образуются гибридные белки, содержащие в N-концевой части бактериальный белок или его часть, а в С-концевой части - эукариотический белок. Примером использования такого способа экспрессии является получение гонадотропного гормона соматостатина в клетках Е. Coli

Получение гонадотропного гормона в клетках Е. Coli разработано К. Итакурой и Г. Бойером. Получение гонадотропного гормона в клетках Е. Coli разработано К. Итакурой и Г. Бойером. Аминокислотная последовательность этого гормона была известна биотехнологам, и исходя из нее, согласно генетическому коду, была выведена структура соответствующего искусственного гена. После этого был осуществлен его синтез: ген содержал на N-конце кодон АТС, кодирующий метионин, и липкий конец, соответствующий расщеплению рестриктазой EcoRI - AATT, а на С-конце - два стоп-кодона. Этот фрагмент ДНК был присоединен к фрагменту гена бета-галактозидазы Е. coli, содержащему в С-концевой части участок расщепления EcoRI, и вместе со своим промотором и оператором был встроен в плазмиду pBR322. В результате такого соединения получен гибридный ген, в котором С-концевая часть гена бета-галактозидазы заменена "геном" соматостатина. Между геном бета-галактозидазы и собственно геном соматостатина находится кодон метионина.

Получение гонадотропного гормона соматостатина через гибридный белок - бета-галактозидазу

Эритропоэтин

Структура молекулы эритропоэтина (схема)

эритропоэтин Гормон гликопротеиновой природы, 165 амк, м.м. 30400. Эритропоэтоин вырабатывается в почках в ответ на тканевую гипоксию. Он воздействует на специфические рецепторы костного мозга и стимулирует пролиферацию, митоз и созревание эритроцитов. Секреция эритропоэтина почками усиливается при кровопотере, различных анемических состояниях (железо-, фолат- и B12-дефицитных анемиях, анемиях, связанных с поражениями костного мозга и др.), при гипоксических состояниях. Как ЛС показан больным с почечной недостаточностью и выраженной анемией. Повышает уровень гемоглобина, полезен при СПИДе и раке. Получение значимых количеств эритропоэтина человека из почек невозможно из-за низкого его содержания. Рекомбинантный человеческий эритропоэтин получают в культуре клеток млекопитающих. Очистка производится ионно-обменной и имунно-афинной хроматографией, производитель - фирма Amgen (США). В РФ НПО «Микроген» выпускает высокоочищенный рекомбинантный эритропоэтин человека с сывороточным альбумином в виде раствора на изотоническом цитратном буфере под названием «Эритростим».