🗊Презентация Биохимические методы исследования в КДЛ

Биохимические методы исследования в КДЛ Биохимические методы исследования в КДЛ

Нефелометрия Нефелометрия основана на феномене рассеивания света, когда падающий луч ударяется в частицу или комплекс антиген — антитело в растворе. В результате этого количество рассеянного света пропорционально количеству антигена. Нефелометрию типично используют для определения уровня специфических белков, которые, связываясь с антителами, образуют крестообразные частицы в растворе. Под нефелометры обычно специализированы отдельные анализаторы, имеющие ограниченное меню тестов, поскольку принцип рассеивания света применим только для молекул размером не больше 40 нм.

Определение светорассеивания

Нефелометрия-измерение рассеянного света

Нефелометрия-измерение рассеянного света. Если известны размеры частиц , то интенсивность рассеянного света при фиксированном угле измерения будет пропорциональна концентрации вещества. Приборы для нефелометрии программируются под измерение определенных компонентов биологической жидкости. Нефелометрия-измерение рассеянного света. Если известны размеры частиц , то интенсивность рассеянного света при фиксированном угле измерения будет пропорциональна концентрации вещества. Приборы для нефелометрии программируются под измерение определенных компонентов биологической жидкости.

Турбидиметрия- измерение прошедшего света по закону Бугера- Ламберта (18 век). В качестве турбидиметра можно использовать боьшинство фотометров и биохимических анализаторов. Турбидиметрия- измерение прошедшего света по закону Бугера- Ламберта (18 век). В качестве турбидиметра можно использовать боьшинство фотометров и биохимических анализаторов.

Фотометрия в современной лаборатории

Измерения по «конечной точке»

Кинетические измерения

Нелинейная многоточечная калибровка

Что же такое современный фотометр?

Требования

Упрощенная оптическая схема фотометра

Классическая оптическая схема фотометра

Влияние квазипаралельности светового потока и длины волны

Влияние юстировки лампы

Влияние квазипаралельности светового потока

Влияние квазипаралельности светового потока и длины волны

Классическая оптическая схема фотометра

Некоторые цифры

Многофункциональные фотометры Наряду с одно- и двухканальными появились и многоканальные фотометры, позволяющие измерять одновременно большое количество проб, что существенно ускоряет процесс измерения.

Преимущества автоматизированных фотометров Главной отличительной особенностью автоматических фотометров (спектрофотометров) от автоматических анализаторов является необходимость вручную смешивать анализируемый образец с реактивами.

Причины использования автоматических анализаторов 1. Экономичность- 350 - 500 мкл (и менее) реагентов (!) 2. Объем анализируемой биологической жидкости (3 - 7 мкл) 3. Высокая производительность (до 800 и более исследований в час). 4. Автоанализатор может эксплуатироваться не менее 5-6 часов в сутки. 5. Возможностью использования разных режимов определения: по конечной точке, двух- многоточечной кинетике, с привлечением технологии турбидиметрии (иммунонефелометрии), ионометрии, поляризационной флюориметрии и других. 6. Возможность программирования под реактивы разных фирм-производителей. 7. Использование небольших (в том числе и моющихся) измерительных кювет. 8. Системный подход, который позволяет "просмотреть" сам ход реакции, выявить фазу исчерпания субстрата, кофакторов (при "ручном" определении это обнаружить невозможно). 9. Осуществление контроля качества. 10. Программное сохранение базы данных. 11. Возможность выполнения экстренных исследований. 12. Связь с компьютерами, выход в ЛИС. 13. Широкие возможности измерительного модуля. позволяют регистрировать абсорбцию (при условии соблюдения закона Бугера-Ламберта-Беера) в диапазоне до 2,5 ед. А, что обусловлено мощным источником облучения и более чувствительным приемником света. 14. Использование неагрессивных жидкостей (Ферментные наборы реагентов). 15. Многие автоанализаторы оснащены ионоселективным блоком, позволяющим, в частности, проводить определения ионов калия, натрия, кальция, хлора потенциометрическим методом.

Анализаторы проточно-инжекторного типа (ПИА) В 60-ых годах XX века Я.Ружичка и Э.Хансен, К.Стюарт предложили новую разновидность непрерывного проточного анализа, а именно: проточно-инжекционный анализ (ПИА) По сравнению с непрерывным проточным анализом проточно-инжекционный анализ (ПИА) позволяет получить информацию не только о концентрации исследуемого образца, но и о кинетике протекаемой реакции. В проточно-инжекционном анализе в качестве способов детектирования используются: абсорбционная фотометрия (42%), флюориметрия, турбидиметрия и др. (28%), электрихимическая детекция (29%), иные способы детекции (около 1%). Использование ПИА позволяет значительно уменьшить объем биопробы и реагентов - за счет возможности осуществлять исследования в кинетическом режиме; обеспечивает высокую производительность системы при повышении точности анализа.

Воспроизводимость результатов Воспроизводимость результатов обеспечивается тем, что на каждый этап исследования всегда отводится один и тот же, притом строго определенный, промежуток времени. Результат анализа рассчитывается путем сопоставления показателей исследования опытной, контрольной и стандартной проб.

Режимы измерения Характер измерения оптической плотности раствора оценивается в следующих режимах: а) по конечной точке (возможность построения калибровочной кривой); б) по кинетике; в) по двум точкам; г) по фиксированной абсорбции; д) оценка результатов по нелинейной калибровке (иммунотурбидиметрия).

Особенности оптической системы регистрации: а) источник света (ксеноновая, галогеновая лампа с длительным сроком эксплуатации, лампа накаливания (вольфрамовая, вольфрамо-галогеновая, ксеноновая, кварцевая, пульсирующа); б) диапазон длин волн; в) монохроматизация светового потока с помощью диффракционной решетки, набора простых или интерференционных светофильтров; г) система детектирования светового сигнала; д) режим фотометрического измерения – монохроматический или бихроматический.

Характер химической процедуры В зависимости от характера химической процедуры исследований различают 4 основные группы методов ПИА. К 1-ой из них относят способы анализа, основанные на обычной "неферментативной" химической реакции. Ко 2-ой - способы определения субстратов с помощью ферментов. К 3-ей - методы исследования активности ферментов. К 4-ой - методы иммунохимического анализа.

Типы анализаторов 1. Одноцелевые биохимические автоанализаторы, с помощью которых в анализируемой пробе определяется лишь один компонент биологической жидкости и ткани. К числу таковых может быть отнесен, например, анализатор "Глюкоза-2" фирмы "Beckman". 2. Автоанализаторы для определения так называемых родственных компонентов. Это, например, автоанализатор аминокислот, принцип действия которого основан на хроматографическом их разделении (по Штейну и Муру); автоматический атомно-абсорбционный пламенный спектрофотометр. 3. Многоцелевые биохимические автоматические устройства, предназ начающиеся для установления содержания в биологических жидкостях большого количества различных по химической природе компонентов.

Дискретные анализаторы Основными узлами дискретных автоанализаторов являются: 1).Карусели (картриджи) с исследуемым биологическим материалом и реагентами. 2).Дозаторы (манипуляторы). 3).Блок измерения концентрации определяемого компонента. 4).Регистрирующее устройство. 5).Система управления комплексом перечисленных модулей.

Альтернатива дискретным анализаторам Своеобразным «компромиссом», объединяющим проточный и дискретный принципы автоматизированного исследования, является р о т а ц и о н н а я с и с т е м а, особенность которой состоит в использовании процесса центрифугирования. При этом смешивание пробы с реактивами, термостатирование и измерение величины оптической плотности осуществляются в период вращения ротора центрифуги: в процессе центрифугирования жидкость перемещается по радиальным каналам ротора в соответствующие кюветы, вращающиеся совместно с ним. Подавляющее большинство применяемых в лаборатории автоанализаторов используют дискретный принцип исследования.

Классификация автоанализаторов в зависимости от особенностей технологии 1-ый класс. Автоанализаторы "BATCH-системы", т.е. выполнения исследований "по тестам". Характерной их конструктивной особенностью является использование проточных кювет. Анализаторы этого типа предназначены для последовательного выполнения отдельных методик (серий исследований). Представляют собой открытые системы. 2-ой класс. Анализаторы селективные -режим работы "по пациентам" - RANDOM. Позволяют выполнять исследование по различным биохимическим тестам путем взятия (с использованием манипулятора) отдельных аликвот одной и той же пробы биологического материала. Как правило, регистрация оптической плотности производится не в проточной, а отдельной реакционной кювете. Приборы этого типа допускают возможность проводить экспресс-анализы (в STAT-режиме: "внеочередного проведения анализа"). 3-ий класс. Многофункциональные интеллектуальные системы. Предназначаются для использования в лабораториях крупных лечебно-профилактических учреждений, диагностических центрах, централизованных клинико-биохимических лабораториях. Содержат иооноселективные блоки.

Основные параметры, на которые нужно обратить внимание при выборе анализатора: - Производительность: количество исследований в час. - Последовательность выполнения анализов: "по тестам" - BATCH или "по пациентам" - RANDOM. - Открытость системы.

Группы методов В зависимости от характера химической процедуры исследовании различают 4 основные группы методов ПИА. К 1-ой из них относят способы анализа, основанные на обычной "неферментативной" химической реакции. Ко 2-ой - способы определения субстратов с помощью ферментов. К 3-ей - методы исследования активности ферментов. К 4-ой - методы иммунохимического анализа.

Сравнение иммуноферментного, иммунохемилюминесцентного и электрохемилюминесцентного методов детекции

История развития иммуно-химических методов анализа 60-е: радиоизотопные методы (высокая чувствительность и специфичность); 70-е: иммуноферментные методы (улучшенная стабильность реагентов, возможность автоматизации); 80-е: иммунохемилюминесцентные методы (сокращенное время инкубации, увеличенная чувствительность); 90-е: электрохемилюминесцентные методы.

Иммунохимические методы При взаимодействии антигена и специфического иммуноглобулина (АТ) образуется высокомолекулярный комплекс . Можно определять АТ с помощью специфических АГ, можно определять АГ с помощью специфических АТ.

Гетерогенный анализ отличается от гомогенного тем, что в реакционной смеси имеются две фазы- твердая( осадок, суспензия) и жидкая, что позволяет отделить комплекс от исходных компонентов. Гетерогенный анализ отличается от гомогенного тем, что в реакционной смеси имеются две фазы- твердая( осадок, суспензия) и жидкая, что позволяет отделить комплекс от исходных компонентов. Самый распространенный вариант гетерогенного анализа- это твердофазный, когда с самого начала один из компонентов реакции фиксирован на твёрдом носителе. Широко распространен вариант ELISA ( ensime linked immunosorbent assay).

Определение индивидуальных белков на основе реакции взаимодействия антиген-антитело. Определение индивидуальных белков на основе реакции взаимодействия антиген-антитело. При взаимодействии АГ с АТ образуется иммунный комплекс, который может выпадать в виде преципитата. Реакция преципитации была использована в методе радиальной иммунодиффузии, предложена в 1964-65 гг.. Манчини Карбонара и Херемансом. Метод радиальной иммунодиффузии не требует специального оборудования, но он довольно длительный, не поддается автоматизации, несет определённую долю субъективизма.

Реакция между АГ и АТ в жидкой фазе. Реакция между АГ и АТ в жидкой фазе. Метод турбидиметрии и нефелометрии. Реакция АГ-АТ прявляется в растворе в виде образования агрегатов.

Лигандный анализ. Лигандный анализ. специфическое связывание с лигандами как аналитический метод начинается с работы Ялоу и Берсон, предложивших в 1960 году метод радиоиммунологического определения (РИА) инсулина. Эта работа была удостоена Нобелевской премии.

В лигандном анализе выделяют три компонента: В лигандном анализе выделяют три компонента: 1) АНАЛИТ- определяемое вещество. Оно может содержаться в анализируемом материале, может быть добавлено в качестве калибратора и т.д.. 2) ЛИГАНД- вещество, избирательно связывающееся с аналитом. 3) МЕТКА- легкоопределяемое соединение, добавляемое в аналитическую систему для измерения количества аналита.

ЭТАПЫ: ЭТАПЫ: Взаимодействие аналита с лигандом. Формирование меченного комплекса. Измерение сигнала (определение количества метки).

ОСНОВНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ: 1.Прямые- определяется количество комплекса аналит- лиганд. При увеличении концентрации аналита сигнал возрастает. 2. Непрямые- определяется количество оставшихся свободными валентностей лиганда.

Иммуноферментный анализ Метод выявления антигенов и антител, основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску.

Иммуноферментный анализ Существует множество вариантов постановки ИФА, из которых наибольшее практическое значение получил гетерогенный твердофазный иммуноферментный анализ. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции.

Иммуноферментный анализ Для ферментативной метки коньюгата могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфотаза, бета-галактозидаза, глюкозооксидаза и др. Во всех коммерческих тест-системах используется пероксидаза хрена, выбор которой определяется ее высокой удельной каталитической активностью, доступностью, стабильностью, простотой детекции.

Иммуноферментный анализ

Конкурентный ИФА для определения антигенов Искомый антиген(1) и меченый ферментом антиген(2) конкурируют друг с другом за антитела (3), сорбированные на твердой фазе.

. Определение АТ в сыворотке больного (в лунках планшеток с сорбированным АГ (прямой ИФА)

Определение АГ в сыворотке больного (в лунках планшеток с сорбированными АТ)прямой ИФА

Иммуноферментный анализ- это: Чувствительность, позволяющая выявлять концентрации до 0,05нг/мл; Возможность использовать минимальные объемы исследуемого материала; Стабильность при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более); Простота проведения реакции; Наличие как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета; Возможность автоматизации всех этапов реакции; Относительно низкая стоимость диагностических наборов.

Иммунохемилюминесцентный метод

Аналитическая чувствительность- Аналитическая чувствительность- (ТТГ третьей генерации - 0,002 IU/ml. ПСА третьей генерации - 0,003 ng/ml.); Производительность - до 120 тестов в час; Автоматическое разведение для некоторых тестов; Количество реагентов, одновременно находящихся на борту - 12; Время выполнения исследования - 42 (72) минуты в зависимости от вида теста.

Иммунохемилюминесцентный метод В состав входят пробирки со специальными  шариками, покрытыми антителами или антигеном, которые используются в качестве твердой фазы реакции. Проба автоматически вносится в пробирку, содержащую шарик. Добавляется коньюгат, меченный ферментом щелочной фосфатазой.

Электрохемилюминесцентный метод

Электрохемилюминесцентный метод Метод основан на детекции эмиссии света, возникшей под воздействием электрического поля. Метка - рутениевый комплекс, чрезвычайно стабильная водорастворимая соль. Рутениевый комплекс способен излучать свет на поверхности электрода при подаче на него напряжения (свечение достигает максимума за доли секунды).

Электрохемилюминесцентный метод 1-я инкубация. Проба + биотинилированное МА+ второе МА, помеченное рутениевым комплеком реагируют собразованием "сэндвич"-комплекса. 2-я инкубация. Добавление микрочастиц, покрытых стрептавидином, связывание комплекса на твердой фазе за счет взаимодействия между биотином и стрептавидином. Реакционная смесь подается в измерительную кювету, где микрочастицы притягиваются магнитом на поверхность электрода. Несвязанные вещества затем удаляются с помощью буфера. После этого подача напряжения на электрод индуцирует хемилюминесцентное излучение, которое измеряется фотоумножителем.

Электрохемилюминесцентный метод Высокая стабильность рутениевой метки (ферменты не используются, что значительно повышает стабильность реакции); Быстрота и надежность возникновения светового сигнала; Высокая -аналитическая чувствительность; В качестве твердой фазы используются мельчайшие (2,8 мкм), покрытые стептовидином магнитные частицы. Частицы находятся в виде суспензии, обеспечивая большую поверхность для иммобилизации иммунных комплексов, что значительно ускоряет реакцию.

Электрохемилюминесцентный метод

Электрохемилюминесцентный метод Короткое время инкубации. (9-18 минут). Аналитическая чувствительность- (ТТГ - 0,005 IU/ml., ПСА - 0,005 ng/ml.); Широкий диапазон измерения; Производительность прибора до 90 анализов в час; Возможность параллельного тестирования - до 15 тестов одновременно; Автоматическое разведение.

Группы методов лабораторной диагностики

Непрямые методы

Прямые методы

Выбор среди прямых методов лаб.диагностики

Тем не менее:

Хроматографические методы исследования Аффинная ЖХВД; Тонкослойная хроматография Техника ТСХ. Приготовление пластинок. Нанесение препаратов. «Проявление» пластинок, обнаружение пятен или полос ( денситометрия). Метод трудоемкий, токсичный.

Иммуноблотинг; Иммуноблотинг; Диагностические наборы для клинической химии; Латекс-тесты для качественного и полуколичественного анализа; Иммунохроматографические тесты на картриджах и тест-полосках; Полоски для анализа мочи.

Преимущества экспресс-методов Анализ без доставки в КДЛ; Получения результатов через 2-20 мин.; Отсутствие дорогостоящих приборов при качественном и полуколичественном анализах; Использование простых приборов-ридеров для количественных исследований;

Иммуноблоттинг Иммуноблоттинг (син. вестернблоттинг) - высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Метод выявления антител к отдельным антигенам возбудителя основан на постановке ИФА на нитроцеллюлозных мембранах, на которые в виде отдельных полос нанесены специфические белки, разделенные гель-электрофорезом. Если имеются антитела против определенных антигенов - появляется темная линия в соответствующем локусе стрипа.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг: виды наборов Вестерн-блот: Наборы содержат тестовые стрипы-мембраны с электрофоретически разделенными нативными антигенами соответствующих инфекционных агентов, т.о. антигены располагаются в порядке молекулярной массы

Иммуноблоттинг: виды наборов Лайн-блот: на тестовые стрип-мембраны нанесены только клинически значимые антигены (нативные, синтетические или рекомбинантные) в определенном порядке. Такой подход используется при дифференциальной диагностике нескольких инфекций на одном стрипе

SOUTHERN BLOT - Процедура была разработана E. M. Southern и в основе ее лежит перенос отрезков ДНК с поверхности геля ПААГ после разделения электрофорезом на нитроцеллюлозный фильтр под воздействием потока солевого элюента, вызываемого его впитыванием в слои фильтровальной бумаги. SOUTHERN BLOT - Процедура была разработана E. M. Southern и в основе ее лежит перенос отрезков ДНК с поверхности геля ПААГ после разделения электрофорезом на нитроцеллюлозный фильтр под воздействием потока солевого элюента, вызываемого его впитыванием в слои фильтровальной бумаги.

SOUTHERN, WESTERN, NORTHERN BLOTS

SOUTHERN, WESTERN, NORTHERN BLOTS На практике это используется для сравнения геномов отдельных лиц с целью выявления патологических изменений в последовательности нуклеотидов или установлении родственных отношений. Патологическая замена ряда нуклеотидов в зоне рестрикции приводит к ее исчезновению и смещению полосы относительно полос пациентов в норме.

IMMUNOCOMB ORGENICS Оригинальная модификация твёрдофазного иммуноферментного анализа на гребенках, реализованная в наборах Иммунокомб, не требует использования дополнительного оборудования и растворов (набор полностью укомплектован и готов к использованию).

IMMUNOCOMB ORGENICS Зубцы пластикового гребня сенсибилизированы соответствующими антигенами или антителами. Ячейки ванночек заполнены готовыми растворами конъюгата, промывочными буферами и красителем

IMMUNOCOMB ORGENICS

Скрининг-тесты для диагностики ревматоидных заболеваний; Для выявления инфекционных заболеваний (кандидоз, инфекционный мононуклеоз, токсоплазмоз, сифилис); Фертильность и бесплодие(ХГч, анти-овариальные АТ, антиспермальные АТ);

Реакция агглютинации Ревматоидный фактор «RF Direct Latex» Изготовитель - VEDA.LAB – Франция РФ латекс-реагент – является суспензией полистироловых частиц, сенсибилизирован-ных гамма-глобулином. При смешивании реагента с образцом сыворотки, содержащим ревматоидный фактор, происходит реакция агглютинации, которая легко регистрируется визуально. Наличие или отсутствие видимой агглютинации указывает на наличие или отсутствие РФ в тестируемом образце.

Иммунохроматографические тесты Диагностика гепатитов,половых инфекций, гриппа А и Б, инфекций ЖКТ, туберкулеза, малярии, прочих инфекций, в том числе и torch-инфекций. Скрининг врожденного гипотириоза (неонатальный ТТГ),выявление гормональной дисфункции щитовидной железы (ТТГ), проблемы беременности ( ХГч, ЛГ, ФСГ), диагностика патологии сосудов (миоглобин, Д-димер, сердечный тропонин и т.д.). Онкомаркеры ( ПСА,АФП, скрытая кровь в фекалиях и т.д.). Наркотический контроль ( Барбитураты, марихуана, Экстази, опиаты и т.д.)

Иммунохроматография В реакции используют антитела к искомому антигену, адсорбированные на микрочастицах (окрашенный латекс или частицы коллоидного золота), и антитела к тому же антигену, иммобилизованные в виде полосы на хроматографической бумаге. Кроме того, в этой реакции имеется внутренний контроль (антивидовые антитела, также закрепленные в виде полосы на хроматографической бумаге).

Тест-полоски для анализа мочи Диагностика декомпенсированной стадии СД, сопровождающегося кетоацидозом и осложненные ренопатией; Диагностика нефрологических заболеваний; Длительность анализа 5-10 мин., высокая чувств. и спец., встроенный контроль качества, возможность тестировать различны типы биологических жидкостей.

Тест-полоски для анализа мочи Тестовые поля представляют собой бумагу, пропитанную стандартным количеством необходимых для реакции компонентов, которые предварительно были стабилизированы с помощью высушивания. Компоненты эти могут быть индикаторами, ферментами или другими добавочными реагентами. При взаимодействии с исследуемой биологической жидкостью реагенты растворяются и вступают в реакцию, которая проявляется окраской различной интенсивности и пропорциональнаконцентрации исследуемого параметра.

Полоски для анализа мочи контролируют: 1. нарушение углеводного обмена: глюкоза кетоновые тела 2. заболевания печени и желчевыводящих путей и гемолитические состояния : уробилиноген, билирубин 3. патологию почек и урогенитального тракта: относительная плотность, рН, нитриты, белок, лейкоциты, .кровь(эритроциты и гемоглобин)‏

Возможно применение видеоцифровых комплексов на базе сканеров EPSON для регистрации анализов с использованием специальных программ. Возможности программ: Получение первичного изображения всех тестов; Контрастирование и увеличение изображения; Сопоставление изображений образцов с контролем; Определение порога для дискриминации положительных и отрицательных образцов; Получение объективных цифровых значений, характеризующих интенсивность реакции и визуальное представление результатов.

Возможно применение видеоцифровых комплексов на базе сканеров EPSON для регистрации анализов с использованием специальных программ. Возможности программ: Получение первичного изображения всех тестов; Контрастирование и увеличение изображения; Сопоставление изображений образцов с контролем; Определение порога для дискриминации положительных и отрицательных образцов; Получение объективных цифровых значений, характеризующих интенсивность реакции и визуальное представление результатов.

Thank you for your attention! Thank you for your attention!