🗊Презентация Матричные биосинтезы

Матричные биосинтезы

Матричные биосинтезы При биосинтезе белков и нуклеиновых кислот матрицей служат нуклеиновые кислоты. Матрица в ходе матричного синтеза не расходуется и может использоваться многократно.

Существует три основных типа матричных биосинтезов. Биосинтез ДНК (репликация ДНК) с использованием в качестве матрицы уже существующих молекул ДНК. Биосинтез РНК на матрице ДНК (транскрипция). Биосинтез белков с использованием в качестве матрицы и-РНК (трансляция).

Основной постулат молекулярной биологии

Генетическая организация генома млекопитающих Гаплоидный геном каждой клетки представлен 3,5*10 парами оснований и состоит из 23 пар хромосом. Это достаточно для кодирования 1,5 мм пар генов. В организме около 100 000 белков. Это означает, что большая часть геномной ДНК не кодируется.

ДНК генома делят на: Уникальные (неповторяющиеся) последовательности ДНК. Они кодируют белки. Повторяющиеся последовательности ДНК. Составляют 20-30% генома. Высоко повторяющиеся последовательности транскрипционно неактивны.

Строение ДНК Молекула ДНК среднего размера имеет длину 4 см. содержит 150 000 000 нуклеотидных пар. Общая длина ДНК в 23 парах хромосом человека 1,5 м. Первичная структура ДНК характеризуется видовой специфичностью

Первичная структура ДНК: порядок чередования дезоксирибонуклеотидов в полинуклеотидной цепи. Мононуклеотиды связаны 3`-5` -фосфодиэфирными связями.

Вторичная структура ДНК: Двойная спираль, которая удерживается за счёт водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями.

Хроматин – комплекс белка с ядерной ДНК. 2/3 хроматина –белки. 1/3 хроматина – ДНК. в хроматине содержится до 10% РНК. Белки, связывающиеся с ДНК делятся на 2 группы: гистоны, негистоновые белки.

Уровни организации хроматина

Уровни организации хромосомы

Гистоны Молекулярная масса 20 000. Хроматин содержит 5 типов гистонов: Н2А, Н2В, Нз,Н4 (нуклеосомные гистоны), Н1. Нуклеосома - фрагмент ДНК, взаимодействующий с комплексом гистонов.

Гистоны Н1 связываются с ДНК в межнуклеосомных участках (линкерных последовательностях) и защищают эти участки от действия нуклеаз.

Гистоны

Негистоновые белки регуляторные белки, белки, участвующие в матричном биосинтезе.

Строение РНК Первичная структура РНК: порядок чередования рибонуклеозидмонофосфатов в полинуклеотидной цепи. Вторичная структура РНК: За счёт водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями образуются спирализованные петли – «шпильки».

Гибридизация Данный метод применяют для изучения видовой специфичности нуклеиновых кислот. Метод основан на способности ДНК к денатурации при нагревании (80-90) и ренатурации при последующем охлаждении.

Репликация воспроизведение (удвоение) молекул ДНК в процессе деления клетки. процесс синтеза дочерней ДНК на матрице ДНК. Структура дочерней ДНК аналогична родительской ДНК.

Функции ДНК сохранение генетической информации, воспроизведение генетической информации, реализация генетической информации,

Механизм репликации ДНК– полуконсервативный. В каждой дочерней молекуле одна нить является старой, а другая – вновь синтезированной.

Постулаты Корнберга (1955 г) Для синтеза ДНК нужны нуклеозидтрифосфаты. Реакция идёт только в присутствии уже готовой ДНК, выполняющей роль матрицы. Поскольку в молекуле ДНК нуклеотидные остатки образуют пары А-Т и Г-Ц, в реакции расходуются одинаковые количества dАТФ и ТТФ (стехиометричекий коэффициент m), dГТФ и dЦТФ(стехиометричекий коэффициент n) Требуется набор ферментов (реплисома).

Синтез нуклеиновых кислот происходит в ядре и митохондриях

Этапы репликации. Инициация репликации. Инициация репликации происходит в нескольких точках хромосомы. Точки инициации репликации- ориджины репликации.

Во время миграции репликативной вилки происходит разделение цепей родительской ДНК с участием ДНК-хеликазы.

Далее действует раскручивающий белок.

ДНК-полимераза α катализирует синтез короткого (до 10 нуклеотидов) олигонуклеотида, то есть праймера, с которого начинается синтез ДНК. ДНК-полимераза α катализирует синтез короткого (до 10 нуклеотидов) олигонуклеотида, то есть праймера, с которого начинается синтез ДНК. Затем на конец одной цепи присоединяется ДНК-полимераза δ (дельта). Расположение оснований в двух нитях не только комплементарно, но и антипараллельно.

Элонгация репликации – репликация обеих материнских цепей ДНК и связывание друг с другом фрагментов новообразованных цепей ДНК. Обе дочерние молекулы сохраняют связь с родительской. Хромосома имеет форму вилки. Обе цепи реплицируются одновременно, хотя имеют разное направление. Рост дочерних цепей должен происходить в противоположных направлениях. Синтез новых цепей идёт в направлении от 5`- к 3`- концу . На одной репликативной вилке синтезируются непрерывная нуклеотидная цепь, на другой – фрагменты Оказаки, которые потом соединяются ДНК-лигазой. Элонгация завершается отделением праймеров, формированием дочерней цепи ДНК.

Элонгация репликации

После завершения репликации происходит метилирование нуклеотидных остатков вновь образованных цепей ДНК. После завершения репликации происходит метилирование нуклеотидных остатков вновь образованных цепей ДНК. На каждом конце хромосомы присутствует специфическая нуклеотидная последовательность (GGG ТТА-теломерная ДНК). Это нужно для сохранения генетической информации. С каждым клеточным циклом ДНК хромосом будет последовательно укорачиваться.

Теломераза обеспечивает восстановление недореплицированных 5`-концов.

Схема удлинения 3`-конца ДНК с помощью РНК-содержащего фермента теломеразы.

Ферменты репликации ДНК-топоизомераза (нуклеаза) разрывает цепь ДНК (3`-5`-фосфодиэфирную связь), а в конце репликации зашивает надрезы. ДНК-хеликаза расплетает двойную спираль ДНК. Белки, дестабилизирующие спираль, связываются с одноцепочечной ДНК и предотвращают комплементарное скручивание матричных цепей.

ДНК-полимеразы имеют цинк в активном центре, для реакции необходим магний. ДНК-полимераза α синтезирует РНК (праймер, затравка) длиной до 10 нуклеотидов. ДНК-полимераза δ продолжает синтез новой непрерывной цепи в направлении от 5`- к 3`- концу (лидирующая цепь). ДНК-полимераза α и ε ведут синтез фрагментов Оказаки на отстающей цепи. Каждый фрагмент Оказаки состоит из 100 нуклеотидов, содержит праймер, который удаляет ДНК-полимераза β. ДНК-лигаза соединяет разрывы отстающей цепи ДНК.

Механизм действия ДНК-полимеразы

Расположение ферментов репликации

Репарация ошибок и повреждений ДНК Молекула ДНК подвергается спонтанным (ошибки репликации) и индуцированным повреждениям (УФО, радиация, химические вещества). Снижение активности ферментов репарации приводит к накоплению повреждений (мутаций) в ДНК.

Деградация и репарация ДНК Дефектная область одной цепи ДНК может быть исправлена по неповреждённой комплементарной цепи. Одноцепочечные разрывы ДНК, вызванные ионизирующей радиацией, может быть репарированы прямым лигированием или рекомбинацией.

Ферменты репарации ДНК-N-гликозидазы обнаруживают и удаляют повреждённые основания ДНК. ДНК-инсертаза присоединяет основания к дезоксирибозе. Эндонуклеаза определяет повреждения и гидролизует 3`-5`-фосфодиэфирную связь. Экзонуклеаза находит место разрыва цепи и удаляет повреждённый участок. ДНК-полимераза β достраивает повреждённую нуклеотидную цепь. ДНК-лигаза соединяет неповреждённый и вновь синтезированный участки цепи ДНК.

Репарация ДНК по механизму вырезания нуклеотидов

Синтез ДНК на матрице РНК (обратная транскрипция) Фермент обратная транскриптаза (ревертаза, РНК-зависимая ДНК-полимераза) был обнаружен в 1970 году Балтимором и Теминым.

Обратная транскриптаза Сначала синтезирует РНК-ДНК-гибрид. Затем фермент РНКаза Н удаляет РНК-цепь, оставшаяся ДНК-цепь служит матрицей для синтеза второй цепи ДНК. Возникает двухцепочечная ДНК-копия, содержащая информацию, первично представленную в виде РНК-генома ретровируса.

Транскрипция- синтез РНК на матрице ДНК.

т-РНК ЦЦА конец соответствует месту присоединения АМК, Псевдоуридиновая петля обеспечивает связывание аминоацил-тРНК с поверхностью рибосомы. Дигидроуридиновая петля – место для узнавания специфического кодона. Антикодон – специфичен и комплементарен кодону м-РНК. Минорные основания в антикодоне играют роль в гибкости считывания согласно гипотезе неоднозначности соответствия.

Структура т-РНК

Синтез идёт из нуклеозидтрифосфатов. Синтез идёт из нуклеозидтрифосфатов. В синтезе участвует ДНК-зависимая-РНК-полимераза. Синтез РНК идёт в направлении от 5`к 3`-концу. Фермент присоединяется к участку ДНК (промотору). На матрице ДНК комплементарно строится полирибонуклеотид, являющийся копией первичной структуры ДНК.

Промотор РНК-полимераза связывается с одной цепью нативной молекулы ДНК в определённой точке (промоторе), вызывая расплетение двойной спирали, где и происходит синтез. РНК-полимераза I участвует в синтезе пре-рРНК. РНК-полимераза II - в синтезе пре-мРНК. РНК-полимераза III - в синтезе пре-тРНК.

Транскрипция- биосинтез матричных РНК.

Экспрессия генов (поток генетической информации) Экспрессия генов (поток генетической информации) включает транскрипцию и трансляцию. Отличия транскрипции от репликации: не требует синтеза праймера, использует не всю молекулу ДНК, а отдельные её сегменты, требует наличия одной из цепей ДНК в качестве матрицы, которая полностью сохраняется, при транскрипции транскрибируются отдельные гены или группы генов, а при репликации кодируется вся родительская ДНК.

м-РНК переносит информацию от ДНК в ядре до цитоплазмы, где она соединяется с рибосомами и служит матрицей, на которой происходит синтез белка, короткоживущая, локализована в ядре и цитоплазме, одноцепочечная, комплементарна одной из цепей ДНК

Расположение функциональных участков на молекуле м-РНК

В транскрипции различают три фазы инициация, элонгация, терминация. Элонгация идёт в направлении от 5`- к 3`- концу антипараллельно матричной цепи ДНК. Активация промотора происходит с помощью белкового фактора – ТАТА. Транскриптон - участок ДНК, ограниченный промотором и сайтом терминации. У эукариотов в состав транскриптона входит один ген.

Процесс транскрипции

Посттранскрипционный процессинг- ферментативные превращения транскриптов, после чего они стают активными. Процессинг включает: кэпирование, сплайсинг, полиаденилирование, метилирование.

Посттранскрипционный процессинг м-РНК

Кэпирование присоединение остатка 7-метилгуанозина к 5`- концу молекулы и-РНК, что защищает РНК от ферментативного распада.

Полиаденилирование присоединение фрагментов АА УАА к 3`- концу и-РНК в ядре или цитоплазме. Это облегчает выход и-РНК из ядра и замедляет гидролиз в цитоплазме.

Сплайсинг генов В ядре происходит сплайсинг генов – ферментативное присоединение одного гена или части гена к другому, а также процесс удаления интронов и соединения экзонов при синтезе м-РНК.

Механизм сплайсинга

Эукариотические гены имеют фрагментарное строение: они состоят из нескольких значащих участков (экзонов), разделённых нетранслируемыми вставками (интронами). Эукариотические гены имеют фрагментарное строение: они состоят из нескольких значащих участков (экзонов), разделённых нетранслируемыми вставками (интронами). Экзон – участок гена, транскрипт которого оказывается в зрелой м-РНК. Он кодирует участок цепи белка. Интрон – вставочная последовательность в гене, которая транскрибируется, но вырезается до трансляции.

Система экзонов и интронов в гене

Сплайсосома координирует сплайсинг. Сплайсосома- комплекс малых ядерных РНК и белков (малых ядерных нуклеопротеинов). Сплайсосома координирует сплайсинг. Сплайсосома- комплекс малых ядерных РНК и белков (малых ядерных нуклеопротеинов). Регуляторные сигналы при транскрипции Энхансеры повышают уровень транскрипции. Силансеры ослабляют уровень транскрипции. Энхансеры и силансеры – участки в нетранскрибируемых последовательностях генома. Рибозимы катализируют сам сплайсинг.

Контроль на уровне транскрипции

Посттранскрипционная модификация т-РНК у т-РНК на 3`-конце формируется акцепторный участок, а в средней части молекулы – антикодон.

Посттранскрипционная модификация пре-рРНК В ходе посттранскрипционной модификации пре-рРНК и связывания со специфическими белками образуется рибосома.

Рибосомы – нуклеопротеиды. Рибосомы характеризуют по скорости их седиментации в центрифужном поле, которая количественно выражается константой седиментации S , выражаемой в единицах Сведберга. 80 S – рибосомы эукариот. Они содержат равное количество белка и РНК. 70 S - рибосомы прокариот. Соотношение РНК : белок = 2:1.

Рибосома состоит из двух субчастиц (30 S + 50 S). В меньшей субъединице содержится 20 белков. В большей содержится 30 белков. На большой субъединице находятся 2 центра: А и Р.

Структура субчастиц рибосом

Полисома объединяет 4-5 рибосом вместе с м-РНК.

Генетический код – способ записи информации об аминокислотах с помощью нуклеотидов.

Свойства генетического кода. Триплетность. Одна АМК кодируется тремя нуклеотидами. Вырожденность. Несколько кодонов кодируют одну и ту же АМК. Однозначность и специфичность. Каждому кодону соответствует одна АМК. Неперекрываемость. Отсутствие знаков препинания. Считывание триплетов идёт без пропусков. Универсальность. Среди 64 кодонов – 3 кодона нонсенс (УАГ, УАА, УГА) бессмысленные. Неоднозначность соответствия в считывании кодонов. Строгая комплементарность в двух первых буквах кодона, в случае же третьей буквы это необязательно.

Аминоацил-тРНК-синтетазы имеют три центра связывания: для АМК, для т-РНК, для АТФ.

Активация аминокислоты Требуется: аминокислота, т-РНК, АТФ, ионы магния, кодазы.

Активация аминокислоты

Схема образования аминоацил-тРНК

Трансляция – синтез белка на матрице РНК. ДНК – код АТГ, и-РНК – кодон УАУ, т –РНК – антикодон АУГ.

Этапы трансляции инициация, элонгация, терминация.

Инициация Инициирующий кодон – АУГ. Рост цепей идёт с N-конца. Синтез начинается с N-формилметионина. Необходимые компоненты: рибосомы, инициирующий кодон, инициаторная аминоацил-тРНК, факторы инициации (IF1, IF2, IF3), ГТФ, ионы магния.

Процесс формилирования предотвращает участие аминогруппы АМК в образовании пептидной связи и обеспечивает синтез белка в направлении от аминогруппы к карбоксильной. Процесс формилирования предотвращает участие аминогруппы АМК в образовании пептидной связи и обеспечивает синтез белка в направлении от аминогруппы к карбоксильной. IF3 первым связывается с малой субъединицей рибосомы. IF3 обеспечивает узнавание участка на м-РНК, куда присоединяется формилметионин-тРНК. IF1 способствует связыванию формилметионин-тРНК с малой субъединицей рибосомы и присоединению к ней м-РНК. IF2 способствует объединению большой и малой субчастиц.

Образование инициаторного комплекса Осуществляется путём присоединения белковых факторов, формилметионин-тРНК, ГТФ к малой субчастице рибосомы, к которой комплементарно антикодону присоединяется м-РНК, при участии кодона АУГ. После присоединения 50S субчастицы рибосома становится функционально активной.

Расположение функциональных центров на малой и большой субчастицах рибосомы

Элонгация трансляции Необходимо: т-РНК, АМК, ГТФ, ионы магния, рибосомы, факторы элонгации, м-РНК

Формилметионин-тРНК поступает сначала на А-центр, а потом на Р-центр. Формилметионин-тРНК поступает сначала на А-центр, а потом на Р-центр. Участок А получает другую АМК. Для этого необходим ГТФ. Рибосома делает «шаг» по м-РНК на один кодон. Формилметионин переходит на А-участок с Р-участка. На А-участке происходит синтез пептидной связи под влиянием пептидилтрансферазы. Рибосома перемещается на один кодон. Дипептид вновь переносится на Р-участок под влиянием пептидилтранслоказы. На А-участок поступает третья АМК. При перебросе в участок А дипептида образуется трипептид.

Элонгационный цикл

Реакция транспептидации

Главное событие транслокации – перемещение пептидил-тРНК Главное событие транслокации – перемещение пептидил-тРНК из А в Р-участок рибосомы. Антикодон тянет за собой кодон матрицы, приводя к перемещению матрицы на один триплет относительно рибосомы.

Для синтеза одной пептидной связи Для синтеза одной пептидной связи нужно 4АТФ: 2 АТФ - на активацию АМК и 2 ГТФ - на включение АМК т-РНК в А-центр и транслокацию.

Терминация Необходимы: рибосомы, факторы терминации (3), м-РНК, терминирующие кодоны УАГ, УАА, УГА. От рибосомы отделяется белок, т-РНК, м-РНК. м-РНК распадается до рибонуклеотидов.

Терминация трансляции

Синтез митохондриальных белков 2% клеточной ДНК находится в митохондриях. Белки, синтезируемые в митохондриях, нерастворимы и участвуют в организации структуры митохондрий.

Посттрансляционная модификация формирование третичной и четвертичной структур – фолдинг (участвуют шапероны), ограниченный протеолиз. присоединение коферментов, простетической группы, гликозилирование, метилирование, гидроксилирование, фосфорилирование, образование дисульфидных связей.

Ингибиторы белкового синтеза 50% антибиотиков являются ингибиторами белкового синтеза, 20% - антибиотиков ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот. Репликацию нарушают антибиотики, химические яды, вирусы.

Ингибиторы репликации Антибиотики (новобиоцин, митомицин) Аналоги азотистых оснований и нуклеозидов (5-бромурацил, 5-фтордезоксиурацил) Алкилирующие агенты (иприт) Мутагены (уретан, гидроксиламин, азотистая кислота и др.)

Ингибиторы синтеза нуклеотидов применяются при лечении лейкозов, опухолей, вирусных заболеваний. Они прекращают репликацию ДНК и деление клеток.

Аналоги нуклеозидов (ИДУ) применяют при лечении вирусных гепатитов. ИДУ отличаются от тимидина лишь тем, что у 5 углеродного атома метильная группа заменена на атом йода. Блокируется синтез ДНК.

Аметоптерин структурный аналог фолиевой кислоты, ингибирует дегидрофолатредуктазу, конкурирует с фолиевой кислотой за фермент, так как структурно похож на неё, но коферментом быть не может. Он ингибирует перенос одноуглеродных остатков, необходимых для синтеза нуклеиновых кислот, содержащихся в клетках белой крови и тем самым снижает их число, резко повышенное при ряде форм острого лейкоза.

Ингибиторы транскрипции Антибиотики Аналоги нуклеозидов (кордицепин, цитозинарабинозид) Алкалоиды (винкристин, винбластин – противоопухолевые препараты) Яды и токсины

Ингибиторы трансляции Антибиотики. Тетрациклин тормозит связывание аминоацил-тРНК с А-центром в рибосоме. Эритромицин тормозит активность пептидилтранслоказы в процессе трансляции, Хлоранфеникол ингибирует пептидилтрансферазу. Яды и токсины (дифтерийный токсин, токсины грибов).

Действие антибиотиков на белковый синтез

Влияние облучения на синтез белков Наиболее чувствительны ткани в состоянии митоза (костный мозг, эпителий кишечника). Наиболее устойчивы - клетки ЦНС. Если повреждаются соматические клетки, то они гибнут или укорачивается срок их жизни. В половых клетках изменения передаются по наследству.

При облучении активируется СРО гибель клетки, мутации, торможение деления.

Действие на репликацию мутации типа делеции, нарушается связь ДНК с гистоновыми и негистоновыми белками, хромосомные аберрации, тормозится репарация ДНК.

Влияние облучения на транскрипцию. подавление активности ферментов транскрипции, нарушение процессинга РНК. Влияние облучения на трансляцию. тормозится сборка инициаторного комплекса, происходит сборка белка с изменённой первичной структурой, появляются функционально неполноценные белки.

Мутации – разнообразные изменения генома. Мутагены – вещества, вызывающие изменения в генах. Обычно зародыш с изменёнными генами организм матери отторгает (выкидыши составляют 15% исходов беременностей). Каждый человек несёт в геноме рецессивные мутации. Наследственные заболевания среди новорожденных составляют 4-6%.

Действие мутагенов

Точечные мутации – в ДНК изменён один нуклеотид. Транзиция – изменение последовательности нуклеотидных пар. АТ ГЦ. Трансверсия (перевёрты). АТ ТА. Вставка нуклеотидов. Делеция – выпадение нуклеотидов.

Антимутагены в-каротин, витамины А, С, Е, селен (чеснок, макароны, молоко, морские продукты).

Генная инженерия – прикладное направление молекулярной генетики, исследующее возможности и способы создания лабораторным путём генетических структур и наследственно изменённых организмов. Генная инженерия подготавливает переход медицины на новый, более высокий уровень её развития и расширяет возможности профилактики и лечения многих заболеваний человека.

Цели генной инженерии Генетическая модификация микроорганизмов для увеличения количества и улучшения качества изначально вырабатываемого данным организмом продукта. Перенос генов млекопитающих и человека в микроорганизмы (бактерии, дрожжи) для синтеза с их помощью специфических белков (гормонов, вакцин, интерферона, ферментов). Генетическая модификация высших растений для увеличения их продуктивности. Генетическая модификация соматических клеток человека с наследственными заболеваниями.

Достижения генетической инженерии С помощью бактерий синтезирован соматотропин, инсулин. Воспроизведён синтез E. Coli человеческого а-интерферона. Получена безопасная вакцина против ящура.

Синтез инсулина Синтез инсулина при помощи методов генной инженерии