🗊 Молекулярно-биологические методы диагностики

Молекулярно-биологические методы диагностики

Участок двойной спирали молекулы ДНК.

Схематическое строение ДНК Многоточием обозначены водородные связи

Строение нуклеотида:

КОМПЛЕМЕНТАРНОСТЬ – последовательность нуклеотидов в одной цепи автоматически определяет строго соответствующую ей последовательность нуклеотидов в КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ ей цепи. Так, азотистое основание Аденин (А) всегда взаимодействует только с комплементарным ему азотистым основанием Тимин (Т) в молекулах ДНК. Одновременно азотистые основания Гуанин (Г) одной цепи взаимодействует только с комплементарними им азотистыми основаниями Цитозин (Ц) другой цепи ДНК (или Урацил (У) в РНК). Комплементарность оснований обеспечивается системой водородных связей.

ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА ДНК варианты форм : линейная, кольцевая, 2-х и 1- цепочечная.

ХРОМАТОСОМ: Нуклеосомный кор содержит октамер гистонов (2 х (Н2а+Н2b+H3+H4)). Нуклеосомный кор образуется при оборачивании октамера гистонов двунитевой спирализованной ДНК на 1,5 оборота, отдельно включается дополнительный белок- гистон Н1.

Хроматосомы напоминают нанизанные на нитку бусины. Следующий этап- сворачивание в спираль очень длинной последовательности “бус”. Эта спираль, в свою очередь, претерпевает сворачивание в двужильные канаты, из которых образуются гроздья, являющиеся небольшой частью хромосомы:

Молекулярно-биологические методы диагностики Гибридизация ДНК Секвенирование ДНК Лигазная цепная реакция Полимеразная цепная реакция

Гибридизация ДНК Метод Эдварда М. Саузерна и Р. Дэйвиса 1975г. Southern – южный блоттинг (ДНК) Northern – северный блоттинг (РНК) Western –западный блоттинг (белок) Eastern – вакантно (углеводы и липиды) blotting – букв. "промокание"

Блоттинг ДНК по Саузерну (1975г)

Блоттинг ДНК по Саузерну

Использование метода гибридизации комплексная диагностика инфекционных заболеваний, наследственные дефекты, установления экспрессии тех или иных генов (в этом случае идет гибридизация с мРНК), то есть отслеживания нарушений обмена веществ. Недостаток – дорогостоящее оборудование.

Секвенирование Метод расшифровки нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот (Секвенирование ДНК по Сэнгеру) Метод расшифровки аминокислотной последовательности в белках Для диагностики не используется

Лигазная цепная реакция (ЛЦР, LCR - ligase chain reaction) В основе метода лежит способность специфического фермента ДНК-зависимой ДНК-лигазы сшивать (лигировать) цепь ДНК в присутствии АТФ и ионов Mg2+ при наличии разрыва фосфодиэфирной связи. Wu и Wallace в 1989г.

Использование Инфекции урогенитального тракта Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis Различные вирусные инфекции

Kary Mullis 1983г. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в биологическом материале (пробе).

Направления генодиагностики (ПЦР): Медицинская диагностика (инфекционные заболевания, санитарно-показательные микроорганизмы в пищевых продуктах) Диагностика генетических и онко-заболеваний Судебная медицина и криминология (идентификация личности, установление отцовства)

ПЦР: компоненты реакции. ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать. Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента. Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК: dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы. Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин. Минеральное масло – предохраняет от испарения и разбрызгивания.

ПЦР: компоненты реакции.

Открытие термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermus aquaticus 1989г. Оптимальная температура 72-80оС

Представитель домена архей - Pyrococcus furiosus. Анаэроб, обитает в термальных источниках с температурой воды 70˚С. Источник Pfu-полимеразы.

Представитель домена архей - Pyrococcus woesei (Zillig 1988). Анаэроб, обитает в термальных источниках с температурой воды 90˚С. Источник Pwo-полимеразы.

Транскрипция ДНК

1-й этап реакции ПЦР (цикл амплификации)

Геометрическая прогрессия нарастания числа амплификонов

Приборы для проведения ПЦР Амплификатор

Настольная центрифуга (скорость 14 500 об/мин)

Термостат - предназначен для термостатирования микропробирок

Настольный ПЦР - бокс

Камера для горизонтального электрофореза S-2N

Флуориметр для детекции результатов ПЦР, позволяющий получить результат, не открывая пробирки, что значительно снижает риск контаминации

Фотография геля, содержащего маркерную ДНК (1) и продукты ПЦР-реакции (2,3). Цифрами показана длина фрагментов ДНК в парах нуклеотидов

Ошибки, встречающиеся при проведении ПЦР-диагностики Контаминация пробы на стадии отбора материала Загрязнение пробы примесями, ингибирующими ПЦР Отбор материала выполнен неадекватно, в пробе отсутствуют клеточные структуры. Разрушение ДНК при транспортировке и хранении пробы Потери ДНК во время пробоподготовки Контаминация в отдельных пробах Тотальная контаминация

Достоинства ПЦР – анализа: Высокая скорость Высокая производительность Высокая чувствительность и специфичность Эффективность в отношении диагностики медленно растущих и некультивируемых микроорганизмов

Недостатки ПЦР – анализа: Узкая направленность (нужно предполагать возбудителя). Проблема контаминации – строгий режим постановки. Наличие ингибиторов (гепарин при анализе крови). Не всегда подходит для контроля после лечения (Обнаруживают как живых, так и умерших м/о), не раньше, чем через 1 месяц.

Молекула ДНК. Строение нуклеотида.