🗊Презентация Cromatografie de lichide de inalta performanta cuplata cu spectrometrie de masă

Cromatografie de lichide de inalta performanta cuplata cu spectrometrie de masă (HPLC-ESI Q-ToF MS) Ing. Loredana Todi

Cromatografie de lichide de inalta performanta (HPLC) Cromatografie de lichide de inalta performanta (HPLC) Spectrometrie de masa (MS) Avantajele cuplarii HPLC-MS

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare Cromatografia de adsorbtie :  faza stationara - adsorbant de tip silicagel/ alte umpluturi pe baza de silice  principiul separarii: etape repetate de adsorbtie-desorbtie  Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa  Interactiuni polare (dipol-dipol) – faza normala Cromatografia de schimb ionic :  suprafata fazei stationare este incarcata ionic, de semn contrar ionilor analitului  specifica analitilor ionici/ionizabili  Interactiuni ionice SEC (GPC) :  umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate  proba este separata functie de marimea ionului solvatat

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

Factorii care influenteaza separarea cromatografica Coloana: dimensiuni (L,d), T Faza stationara: natura, diametrul particulelor Faza mobila: tipul de elutie, debitul, solventii Analitul: polaritate, masa moleculara, concentratie

Metode de ionizare

Componentele spectrometrului de masa Agilent 6520 Sursa ionizare ESI (evaporare & ionizare) Sisteme de mentinere a vacuumului (pompa rotativa, pompe turbomoleculare) Elemente de ghidare si focusarea fasciculului de ioni Analizoare de masa Q, ToF (CC/RF- Scan sau SIM) Detector de ioni si Amplificator de semnal Sistem de control si achizitie a datelor

Factorii care influenteaza procesul ESI Natura probei: pH, puritate, polaritatea analitului, caracter covalent/ionic, mic/macro-molecular Concentratia analitului Natura solventului: tensiune superficiala, polaritate, vascozitate, constanta dielectrica, volatilitate, debit; ► solventul ideal – functie de natura analitului: modul ESI (+) : 50% CH3OH/ CH3CN si 50% H20 modul ESI (-) : solventi halogenati: CH2Cl2, CHCl3

Ce tipuri de analiti pot fi analizati prin ESI-Q-ToF-MS? Molecule organice volatile si mai ales nevolatile, labile termic Molecule polare/ polarizabile - solubile in solventi polari si volatili R-NH2, R-COOH, R-SO3H, R-OH, R-O-R, R-CHO, R1-CO-R2, zaharide etc Biopolimeri Proteine, peptide, ADN, ARN, polizaharide Polimeri sintetici Complecsi organometalici

Caracterizarea polimerilor sintetici prin spectrometria de masa Caracterizarea compusilor macromoleculari de origine sintetica presupune determinarea unor parametri specifici: Natura chimica a catenei principale Arhitectura catenei: liniara, ramificata sau macrociclu Natura capetelor de lant Biopolimeri - [M-H]+ ; polimeri sintetici cu grupari ionizabile : polieteri, poliesteri, poliacrilati polimetacrilati, polisiloxani, etc.- [M-Me]+: Na+, K+, NH4+ Polimerii sintetici fara heteroatomi dar cu duble legaturi: polistirenul, polibutadiena sau poliizoprenul: Cu, Ag, Cs, Rb, Co (interactii cu legaturile duble) Polimerii sintetici fara heteroatomi si fara legaturi duble : polietilena si polipropilena - dificil de analizat prin ESI Intensitatea semnalului produs de detector - proportional cu numarul de molecule Ni (Abundenta) de aceeasi masa Mi care il lovesc in acelasi moment - calculul Mn, Mw si IP Structura ionior proveniti de la homopolimeri analizati in spectrometria de masa este de forma: In cazul copolimerilor gradul de complexitate a spectrelor obtinute creste → analiza devine foarte dificila: spectru teoretic care poate fi comparat cu spectrul obtinut practic.

Spectrul ESI-MS al proteinelor (polimeri naturali)

Spectrul ESI-MS polimerilor naturali

Avantajele cuplarii HPLC/MS Cromatografia – metoda “oarba” → achizitie simultana atat a timpilor de retentie, cat si a maselor moleculare ale componentilor din amestec ; Polimeri sintetici cu indice de polidispersitate crescut – eficienta de ionizare inegala pentru componentii probei – necesarea separarea prealabila – LC sau GPC Nu exista degradare termica Analiza rapida Cantitati foarte mici de proba, sensibilitate inalta Informatii structurale prin LC/MS/MS Masa moleculara medie sau indicii de polidispersitate pot fi utilizate pentru a verifica procedurile de sinteza, in studiul mecanismelor de degradare, determinarea aditivilor si a impuritatilor, etc. Determinarea masei moleculare absolute a lanturilor macromoleculare spre deosebire de tehnicile cromatografice precum SEC care furnizeaza valori relative.