🗊Презентация Praktická cvičení z biochemie

1. METODY MĚŘENÍ pH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE pH a izoelektrický bod

1. METODY MĚŘENÍ PH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE Potenciometrie

1. METODY MĚŘENÍ pH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE Potenciometrie

1. METODY MĚŘENÍ PH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE Potenciometrická titrace

1. METODY MĚŘENÍ PH A POTENCIOMETRICKÁ TITRACE Tvary titračních křivek

2. FOTOMETRIE optická metoda analytické chemie zabývá se vlastností chemických látek pohlcovat část elektromagnetického záření (nejčastěji světla, IR, UV) pro látky je specifické pohlcovat různé části spekter s různou intenzitou dle jejich absorpčních vlastností můžeme zjišťovat koncentrace látek v roztoku či jeho složení Absorpce záření - lze sledovat pomocí absorpčního spektra (závislosti množství absorbovaného záření na vlnové délce/vlnočtu) měření tzv. absorbance dané látky (spektro)fotometrem ZÁKON LAMBERTŮV-BEERŮV Prochází-li paprsek monochromatického záření optickou vrstvou, která toto záření pohlcuje, intenzita původního záření se zeslabí.

2. FOTOMETRIE Transmitance /propustnost/ - poměr intenzity záření prošlého k intenzitě záření původního Hodnoty 0 - 1 (0 - 100% ) Absorbance /extinkce/ - logaritmický poměr intenzity původního záření k intenzitě záření prošlého Hodnoty 0 - ∞ Při absorbanci A= 0 (T = 1) se záření vůbec neabsorbuje / při absorbanci A= ∞ (T= 0) se záření pohltí úplně absorbanci měří přístroj (fotometr) skrze kyvetu s roztokem jež do přístroje vkládáme Absorpční křivka – specifická křivka pro chemická činidla jež ukazuje závislost absorpce záření na vlnové délce Kalibrační křivka – přímá úměrnost koncentrace látky a její absorbance kontrola L-B zákona vynesením závislosti A= f(c)

3. POLARIMETRIE založená na měření optické otáčivosti - stočení roviny polarizovaného světla opticky aktivní látkou OPTICKY AKTIVNÍ LÁTKY Schopnost otáčet rovinu polarizovaného světla Většinou organické sloučeniny s asymetrickým uhlíkem =chirální uhlík - nese 4 odlišné substituenty (dále: anorganické látky s asymetrickou molekulou, krystaly) Podle smyslu otáčení: PRAVOTOČIVÉ (+) a LEVOTOČIVÉ (-) Úhel otočení souvisí se strukturou látky a koncentrací Charakterizující konstanta opticky aktivních látek - Měrná otáčivost Závisí na vlnové délce, teplotě a koncentraci Měření optické otáčivosti polarimetrem

3. POLARIMETRIE Měřením získáme úhel otočení (ve stupních) potřebný pro vypočítání koncentrace látky VYUŽITÍ POLARIMETRIE: Kontrola čistoty směsí chirálních látek, Měření koncentrace sacharidů v cukrovarnictví a potravinářském průmyslu ve farmacii a biochemii stanovení bílkovin, steroidů, vitamínů či alkaloidů

5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA OSMÓZA: Dva různě koncentrované roztoky od sebe odděleny semipermeabilní membránou propustnou pouze pro molekuly rozpouštědla část rozpouštědla přejde z místa nižší koncentrace do místa s vyšší koncentrací tak, aby došlo k vyrovnání rozdílu OSMOTICKÝ TLAK: tlak, který musíme vyvinout na koncentrovanější roztok, aby se zabránilo osmóze. ONKOTICKÝ TLAK: osmotický tlak bílkovinné složky plazmy a činí cca 0,3% celkového osmotického tlaku plazmy. REVERZNÍ OSMÓZA na roztok působí tlak, která je od čistého rozpouštědla oddělen polopropustnou membránou Při dostatečném tlaku dochází k opačnému toku rozpouštědla než u osmosy

Příklady osmózy

5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA OSMOLALITA Pro vyjádření osmotických poměrů v roztoku Vyjadřuje celkové látkové množství všech osmoticky aktivních částic rozpuštěných v jednotkové hmotnosti čistého rozpouštědla Jednotkou je mol/kg resp. mmol/kg Osmolalitě 1mol/kg odpovídá osmotický tlak 2,7 Mpa Osmolalita moči: 50-1400 mmol/kg H2O – v rozmezí se pohybuje v závislosti na pitném režimu a koncentraci iontů v organismu TONICITA Rozdíl osmotického tlaku mezi prostředími V lidské fyziologii ve krevní plasmě IZOTONICKÝ ROZTOK - stejný osmotický tlak jako plasma HYPOTONICKÝ ROZTOK - nižší osmotický tlak než plasma HYPERTONICKÝ ROZTOK - vyšší osmotický tlak než plasma

5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA DIALÝZA Dělící metoda, při niž se uplatňuje difúze a současně polopropustnost membrány děj, při kterém jsou od sebe odděleny látky s různou rozpustností a velikostí molekul Prakticky se tak děje přechodem analyticky disperzních látek přes polopropustnou membránu z prostředí s vyšší koncentrací těchto látek do prostředí s nižší koncentrací HEMODIALÝZA metoda odstraňování odpadních látek jako např. draslík, močovina, a nadbytečné vody z krve při selhání ledvin Krev pacienta proudí kolem semipermeabilních membrán, které dovolují vyrovnání koncentrací nízkomolekulárních látek s dialyzačním roztokem na druhé straně membrány, zatímco plasmatické proteiny a krevní buňky přes dialyzační membránu neprocházejí a neztrácení se PERITONEÁLNÍ DIALÝZA - na rozdíl od hemodialýzy využívá peritoneum pacienta DIALYZAČNÍ ROZTOK - vodný roztok obsahující glukózu a různé ionty (např. draselné, sodné…)

5. OMOSA, MĚŘENÍ A PORUCHY OSMOLALITY, DIALYSA KRYOSKOPIE Metoda založena na kryoskopickém efektu - snížení teploty tuhnutí rozpouštědla po rozpuštění dané látky Měření kryoskopem (osmometrem) KRYOSKOPICKÝ EFEKT - snížení teploty tuhnutí EBULIOSKOPICKÝ EFEKT - zvýšení bodu varu Vlastnost závisí na počtu částic, ne na jejich identitě Rozdíl teplot tuhnutí a čistého rozpouštědla je přímo úměrný osmolalitě a nepřímo úměrný molární hmotnosti rozpuštěné látky

???otázka??? ANTIOXIDANTY Při metabolických pochodech vznikají reaktivní formy kyslíku ROS a reaktivní formy dusíku RNS Souhrnně označované jako RONS Zahrnují volné radikály i látky neradikálové povahy

???otázka??? ANTIOXIDANTY látky schopné reagovat a ukončit existenci volných radikálů Vyčerpání antioxidantů v těle vede k poškození tkáně v důsledku procesů označovaných jako oxidační stres (sportování, psychický stres…) Antioxidační kapacita - míra schopnosti tkáně odolávat oxidačnímu stresu, závislá na množství a druhu antioxidantů ve tkáni VOLNÉ RADIKÁLY = molekuly, atomy či ionty, schopné samostatné existence mající alespoň jeden volný nepárový elektron ve valenční sféře Vznikají: 1) Homolitické štěpení kovalentní vazby na dvě částice 2) Redukce -přidáním jednoho elektronu 3) Oxidací -ztrátou jednoho elektronu Šíří se jako řetězová reakce. Volný radikál se stabilizuje vytržením elektronu z nejbližší molekuly, která se pak stává radikálem.

???otázka??? ANTIOXIDANTY PŘÍČINY VZNIKU RADIKÁLŮ Do organizmu se volné radikály dostávají z vnějšího prostředí, ale celá řada z nich vzniká i během metabolických procesů Rozdělujeme příčiny jejich vzniku na exogenní a endogenní: Exogenní: ionizující záření, UV záření, vysoký obsah škodlivin ve vzduchu, kouření, intoxikace, potrava Endogenní: vznik kyseliny močové, rozpad fagocytů a makrofágů, vznik methemoglobinu, syntéza prostaglandinů, zvýšený metabolizmus estrogenů, autooxidace thiolů, hyperglykémie DISMUTACE A FENTONOVA REAKCE Protože se superoxidový radikál řadí mezi nestabilní molekuly, v organizmu snadno podléhá dismutaci za vzniku zmíněného peroxidu vodíku: O2-· + O2-·  O2+ H2O2 Ten je relativně stabilní a má schopnost pronikat v tělních tekutinách i do větších vzdáleností. S biologickými molekulami reaguje velmi pomalu a jeho reakcí s dvoumocným železem vzniká hydroxylový radikál (Fentonova reakce): H2O2 + Fe2+ Fe3+ + ·OH + OH- . Trojmocné železo může být redukováno superoxidem, takže se kruh pro další uzavírá.

???otázka??? ANTIOXIDANTY NERADIKÁLY neradikály mohou snadno v radikály přecházet a tím mohou poškozovat buňku mohou vznikat reakcí dvou radikálů (-> nepřímo nám řeknou, že v těle radikály jsou) NO• + O2•- ——→ OONO- Peroxynitrit OONO- je silné oxidační činidlo Fentonova reakce: H2O2 + Fe2+ → HO• + OH− + Fe3+ místo železa může být i jiný přechodný kov (Cu,Zn,..) hydroxylový radikál HO• je silné oxidační činidlo vytrhuje elektron z nenasycených mastných kyselin hydroxyluje AMK a baze NK

8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE CHROMATOGRAFIE Dělící metoda, při niž se distribuují složky mezi stacionární a mobilní fází Mobilní fáze - kapalina nebo plyn Stacionární fáze - pevná látka nebo kapalina Složka s velkou KD je převážně ve stacionární fázi a bude se pohybovat pomaleji než složka v malou KD, která je převážně ve fázi mobilní Čím více se látka váže na stacionární fázi, tím pomaleji se pohybuje Čím více se látka váže na fázi mobilní, tím rychleji se pohybuje

8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE ROZDĚLENÍ CHROMATOGRAFICKÝCH METOD PODLE ZPŮSOBU PROVEDENÍ SLOUPCOVÁ CHROMATOGRAFIE (chromatografie na koloně) Kolona - trubice naplněná chromatograficky aktivním materiálem Udává se poměr vnitřního průměru kolony a délky sloupce pevné fáze Impregnace - zakotvení stacionární fáze na nosič  nanesení vzorku  vyvýjení Eluát - mobilní fáze vytékající z kolony v průběhu eluce se postupně sbírají frakce buď ve stejných časových intervalech nebo se odebírá stejný objem Vyhodnocení nejčastěji fotometricky, grafickým znázerněním průběhu eluce - eluční křivka CHROMATOGRAFIE V PLOŠNÉM USPOŘÁDÁNÍ Stacionární fáze - arch chromatografického papíru nebo tenká vrstva adsorbentu na pevné podložce Obvykle pouze identifikace látek, práce se standardy Identifikace látek pomocí retardačního faktoru Rf Místo nanesení vzorku - start Poloha mobilní fáze v okamžiku přerušení vyvíjení - čelo Retardační faktor = poměr vzdálenosti start - těžiště skvrny vzorku (A) ku vzdálenosti start - čelo (B)

8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE ROZDĚLOVACÍ CHROMATOGRAFIE Stacionární fáze je kapalina (na vhodném nosiči), která se nemísí s kapalinou mobilní fáze K dělení dochází, mají-li látky rozdílné rozdělovací konstanty Chromatografický papír stacionární fáze – voda vázaná asi 5% na celulosu mobilní fáze – organické rozpouštědlo nebo jejich směsi s vodou dělení: vzestupná – rozpouštědlo zdola nahoru sestupná – naopak kruhová – radiálně od středu papíru dvojrozměrná – nejprve v jednom směru a poté ve směru kolmém na směr první Vyvíjení ve skleněných uzavřených komorách  usušení chromatogramu  postříkat vhodným činidlem(výrazná barevná reakce), někdy UV detekce Vyhodnocení pomocí retardačního faktoru a srovnání s paralelně nanesenými standardy Rf=A/B A=start-těžiště skvrny, B=start-čelo  

8. ROZDĚLOVACÍ A ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE Stacionární fáze - pevná látka s adsorpčními vlastnostmi mobilní fáze - kapalina nebo plyn Směsi se dělí na základě rozdílné adsorpční afinity stacionární fáze k molekulám rozpuštěných látek. TLC – TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE Mobilní fáze - organické rozpouštědlo Tenká vrstva stacionární fáze - oxid křemičitý spojený sádrou nebo škrobem (v případě dělení rostlinných pigmentů), vhodný hydrofilní absorbent je oxid hlinitý  poutá nejpevněji vodu. Vlastní vzorek není ponořen do rozpouštědla, ale rozpouštědlo se na start dostává jen vzlínáním

9. IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE A GELOVÁ FILTRACE IONTOVĚ VÝMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE (IONEXOVÁ) Stacionární fáze - iontoměnič, ionex mobilní fáze - kapalina Metoda slouží k dělení látek iontové povahy - působením elektrostatických sil mezi ionty rozpuštěnými v mobilní fázi a disociovanými funkčními skupinami iontoměniče Iontomeniče - anorganické nebo organické vysokomolekulární látky - schopny vyměňovat ionty Důležitá konstanta - kapacita (C) - udává látkové množství iontu, které je schopen zachytit 1 ml ionexu Katex - nerozpustná, vhodně zesíťovaná makromolekulární látka - na svém řetězci anorganická, snadno disociovatelná funkční skupina (např -SO3H) Ve styku s vodou  molekuly vody vyponí oka katexu  protony se shromažďují uvnitř ok  voda vně ok - mizivé množství protonů, zatím co uvnitř ok je koncentrace protonů vysoká  přidání roztoku disociované soli  kationty Na+ do nitra katexu a vytěsní ekvivalentní množství iontů H+ , které místo nich uniknou do okolí Anex - podobné vlastnosti jako katex, ale vyměňují anionty

GELOVÁ CHROMATOGRAFIE GELOVÁ CHROMATOGRAFIE Stacionární fáze- polymerní gel pravidelného prostorového uspořádání mobilní fáze - kapalina Složky se dělí na základě rozdílné velikosti molekul látky, jejichž molekuly jsou větší než průměr pórů v gelu, nemohou do něj proniknout a postupují vpřed s mobilní fází. Menší molekuly pronikají do prostorových děr a jejich pohyb se zpomaluje AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE umožňuje oddělit z komplexní směsi přinejmenším omezenou skupinu příbuzných proteinů, nebo i jen jeden určitý protein technika je založena na použití imobilizovaného ligandu (navázán na stacionární fázi) reagující specificky s enzymem, který má být očištěn Po přidání směsi proteinů k takovémuto ligandu se na něj vážou jen ty proteiny, které s ligandem tvoří silné vazby Zbytek směsi protéká kolonou beze změny odváděn mobilní fází. Navázaný protein se následně euluje z imobilizovaného ligandu pomocí vysoce koncentrovaného roztoku solí nebo i roztokem s rozpustnou formou ligandu.