🗊Презентация Ферменты гидролиза и биосинтеза нуклеиновых кислот

Ферменты гидролиза и биосинтеза нуклеиновых кислот

Международная классификация ферментов КФ 1 (EC 1): Оксидоредуктазы, катализирующие окисление или восстановление. Примеры: каталаза, алкогольдегидрогеназа КФ 2 (EC 2): Трансферазы, катализирующие перенос химических групп с одной молекулы субстрата на другую. Среди трансфераз особо выделяют киназы, переносящие фосфатную группу, как правило, с молекулы АТФ. КФ 3 (EC 3): Гидролазы, катализирующие гидролиз химических связей. Примеры: эстеразы, пепсин, трипсин, амилаза, липопротеинлипаза КФ 4 (EC 4): Лиазы, катализирующие разрыв химических связей без гидролиза с образованием двойной связи в одном из продуктов. КФ 5 (EC 5): Изомеразы, катализирующие структурные или геометрические изменения в молекуле субстрата. КФ 6 (EC 6): Лигазы, катализирующие образование химических связей между субстратами за счет гидролиза АТФ. Примеры: ДНК-полимераза

Нуклеаза (EC-3) - фермент, расщепляющий нуклеиновые кислоты в живых организмах. Нуклеаза (EC-3) - фермент, расщепляющий нуклеиновые кислоты в живых организмах. Нуклеазы участвуют: - в переваривании нуклеиновых кислот пищи; - в удалении чужеродных нуклениновых кислот; и - в регуляции синтеза и распада нуклеиновых кислот в клетках.

Энзиматический гидролиз Экзо- и эндонкулеазы с 3’- или 5’-конца либо по середине цепи Расщепление цепи по а- и b- типу. продукт 5’-фосфат – а-тип (N-p-N) продукт 3’-фосфат – b-тип (N-p-N) Специфичность к ДНК или РНК ДНазы и РНазы Отношение к фосфату фосфодиэстеразы Фосфомоноэстеразы

Экзонуклеаза

Эндонуклеазы

Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы)

В 1973 году Смит и Натанс предложили номенклатуру рестриктаз, включающую следующие пункты: 1. Аббревиатура названия каждого фермента является производной от бинарного названия микроорганизма, содержащего данную метилазно-рестриктазную систему. Составляют по правилу: к первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида. Streptomyces albus - Sal, Escherichia coli - Eco 2. В случае необходимости добавляют обозначение серотипа или штамма, например, Есо B. 3. Различные системы рестрикции - модификации, кодируемые одной бактериальной клеткой, обозначают римскими цифрами: Hind II, Hind I, Hind III (Haemophilus influenzae). 4. Рестриктазы обозначают буквой R (R Hind III), метилазы - М (М Hind III). В 1973 году Смит и Натанс предложили номенклатуру рестриктаз, включающую следующие пункты: 1. Аббревиатура названия каждого фермента является производной от бинарного названия микроорганизма, содержащего данную метилазно-рестриктазную систему. Составляют по правилу: к первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида. Streptomyces albus - Sal, Escherichia coli - Eco 2. В случае необходимости добавляют обозначение серотипа или штамма, например, Есо B. 3. Различные системы рестрикции - модификации, кодируемые одной бактериальной клеткой, обозначают римскими цифрами: Hind II, Hind I, Hind III (Haemophilus influenzae). 4. Рестриктазы обозначают буквой R (R Hind III), метилазы - М (М Hind III). Открытие новых рестриктаз заставило Робертса в 1978 году внести дополнения в систему рациональных обозначений ферментов: если сокращенное название совпадает для нескольких ферментов, то 2 первые буквы аббревиатуры остаются неизменными, а третья берется из последующих букв видового названия: Haemophilus parainfluenzae - Hpa I Haemophilus parahaemolyticus - Hph I. Изошизомеры – ферменты рестрикции выделенные из разных источников и узнающие одинаковые последовательности.

Рестрикция ДНК и гель-электрофорез рестриктных фрагментов

Ферменты синтеза нуклеиновых кислот ДНК-полимераза РНК-зависимая ДНК полимераза РНК-полимераза Poly(A)-полимераза ДНК-лигаза РНК-лигаза Терминальная трансфераза Полинуклеотидкиназа Щелочная фосфатаза

ДНК-полимераза I (E.coli) Фермент состоит из одной полинуклеотидной цепи (мол. Масса 109 000) обладающей тремя типами ферментартивной активности.

Большой фрагмент ДНК-полимераза I E.coli (фрагмент Кленова) Фермент состоит из одной полипептидной цепи (мол.масса 76000), полученной при расщеплении нативной ДНК полимеразы I субтилизином. Обладает 5’-3’ полимеразной активностью и 3’-5’ экзонуклеазной активностью.

ДНК полимераза фага Т4 (из E.coli, инфицированной фагом Т4) Подобно фрагменту Кленова ДНК-полимеразы I из E.coli. Обладает 5’-3’ полимеразной активностью и 3’-5’-экзонуклеазной активностью. Однако экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы фага Т4 более чем в 200 раз превышает экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы I. Реакция обмена. В присутствии только одного dNTP в результате 3’-5’-нуклеазной активности фермента происходит деградация дцДНК, начиная с 3’-ОН-конца до основания, комплементарного внесенному dNTP. Далее с этого места начинается серия реакций синтеза и обмена. Применение Концевое включение метки в фрагмент ДНК с выступающими 5’-концами Концевое включение метки в фрагмент ДНК с тупыми концами или выступающими 5’-концами Включение метки в фрагменты ДНК, используемые в качестве гибридизационных зондов. Определение нуклеотидной последовательности ДНК «плюс-минус» методом

Полинуклеотидкиназа фага Т4 Фермент катализирует перенос -фосфата на 5’-ОН-конец ДНК или РНК Применение Включение метки в 5’-концы ДНК для определения последовательности по методу Максама-Гилберта Фосфорилирование синтетических линкеров и различных фрагментов ДНК, у которых отсутствует концевой 5’-фосфат перед лигирование.

РНК-зависимая ДНК полимераза (обратная транскриптаза) Фермент состоит из двух полипептидов цепей, один из которых обладает и 5’-3’-полимеразной активностью, и специфической по отношению к РНК-ДНК-гибридам двухсторонней рибонуклеазной активностью. Применение: Синтез кДНКдля клонирования (и первой и второй цепи) или для использования в качестве гибридизационных зондов. Концевое включение метки в ДНК с выступающими 5’-концами (реакция достраивания)

Щелочная фосфатаза (из бактерий (BAP), из кишечника теленка (CIP)) Фермент катализирует отщепление 5’-фосфатных остатков ДНК, РНК, рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Применение Отщепление 5’-фосфатов от ДНК или РНК перед включением 5’-концевого 32Р Отщепление 5’-фосфатов от фрагментов ДНК для предотвращения сшивания концов одной молекулы.

Poly(A)-полимераза (E.coli) Фермент катализирует присоедиение АМР (полученных из АТР) к свободному 3’-ОН-концу РНК Применение Подготовка poly(A)-РНК для клонирования Включение метки в 3’-конец РНК с помощью [a-32Р]АТР для получения гибридизационных зондов

ДНК-лигаза фага Т4 Фермент состоит из одной полипептидной цепи (мол.масса 68000), катализирует образование фосфодиэфирной связи между 3’-OH и 5’-фосфатными концами ДНК Применение Сшивание молекул ДНК с совместимыми липкими концами. Сшивание двухцепочечных молекул ДНК с тупыми концами друг с другом или синтетическими линкерами. Активность ДНК-лигазы фага Т4 по отношению к молекулам ДНК с тупами концами может быть повышена примерно в 20 раз при добавлении РНК-лигазы фага Т4

РНК-лигаза фага Т4 Фермент катализирует ковалентное соединение фосфорилированных по 5’-концу одноцепочечных ДНК или РНК с одноцепочечными ДНК или РНК имеющими 3’-гидроксильные группы Применение РНК-лигаза фага Т4 повышает эффективность сшивания двухцепочечных молекул ДНК с тупыми концами, катализируемого ДНК-лигазой фага Т4

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (из тимуса теленка) Фермент катализирует присоедиение дезоксинуклеотидов к 3’-ОН-концу молекулы ДНК. Применеиние Присоединение комплементарных концевых гомополимерных последовательностей к вектору или к кДНК Включение метки в 3’-концы фрагментов ДНК с помощью меченого 32P-3’нуклеозида. Для введения метки в составе рибонуклеозида используют [-32Р]rNTP с последующей обработкой щелочью.

http://humbio.ru/humbio/default.htm http://www.dnaftb.org/dnaftb/ http://www.dnalc.org/home.html http://www.ch.cam.ac.uk/magnus/molecules/nucleic/index.html