🗊Криосохранение крупных биологических объектов

Криосохранение крупных биологических объектов

Наиболее интригующая область приложения криобиологии – науки о влиянии низких и сверхнизких температур на биологические объекты – поиск возможностей сохранения живых организмов или отдельных органов в состоянии глубокой заморозки. Наиболее интригующая область приложения криобиологии – науки о влиянии низких и сверхнизких температур на биологические объекты – поиск возможностей сохранения живых организмов или отдельных органов в состоянии глубокой заморозки. Методика криосохранения отдельных клеток или, например, эмбрионов разработана неплохо, но обратимое (т.е. с сохранением жизнеспособности после размораживания) замораживание крупных объектов наталкивается на серьезные препятствия. Основная трудность состоит в том, что при больших объеме и массе трудно добиться равномерного охлаждения. Неравномерное же замерзание приводит к серьезным и необратимым повреждениям клеток и тканей. Между тем решение этой проблемы могло бы помочь, например, созданию банка органов для трансплантации и тем самым спасти жизнь тысячам больных. Еще более заманчивой выглядит возможность сохранения в состоянии глубокого охлаждения тяжелобольного – до тех пор, пока медицина не окажется в состоянии ему помочь, может быть, через десятилетия.

Наибольшую опасность при замораживании представляет механическое повреждение мембран клеток образующимися кристаллами льда. Образуясь как вне, так и – что гораздо опаснее – внутри клеток, они разрывают липидный бимолекулярный слой, формирующий эти мембраны. Наибольшую опасность при замораживании представляет механическое повреждение мембран клеток образующимися кристаллами льда. Образуясь как вне, так и – что гораздо опаснее – внутри клеток, они разрывают липидный бимолекулярный слой, формирующий эти мембраны. Для защиты клеток от повреждения при замораживании используют специальные вещества – криопротекторы. Они делятся на две группы: проникающие внутрь клетки, или эндоцеллюлярные (диметилсульфоксид (ДМСО), ацетамид, пропиленгликоль, глицерин, этиленгликоль), и не проникающие или экзоцеллюлярные (полиэтиленгликоли и полиэтиленоксиды, фиколл, сахароза, трегалоза и др.), которые действуют снаружи, осмотически вытягивая из клетки воду.

Наиболее широкое применение нашли глицерин и ДМСО. При добавлении их к воде температура ее замерзания понижается, достигая низшего значения при соотношении примерно 2:1. Эта наиболее низкая температура называется эвтектической, или криогидратной. При дальнейшем же охлаждении таких смесей размеры образующихся кристаллов льда оказываются столь мелкими (сравнимыми с размером кристаллической ячейки), что они не наносят значительных повреждений структурам клеток. Наиболее широкое применение нашли глицерин и ДМСО. При добавлении их к воде температура ее замерзания понижается, достигая низшего значения при соотношении примерно 2:1. Эта наиболее низкая температура называется эвтектической, или криогидратной. При дальнейшем же охлаждении таких смесей размеры образующихся кристаллов льда оказываются столь мелкими (сравнимыми с размером кристаллической ячейки), что они не наносят значительных повреждений структурам клеток. Если бы можно было довести концентрацию криопротектора в живых тканях до эвтектической, это позволило бы полностью решить проблему повреждения тканей ледяными кристаллами. Однако при таких концентрациях любые известные криопротекторы оказываются токсичными.

На практике используют концентрации криопротекторов значительно меньшие, чем эвтектические, – и при этом часть воды все же замерзает. На практике используют концентрации криопротекторов значительно меньшие, чем эвтектические, – и при этом часть воды все же замерзает. Так при использовании 27%-ного раствора глицерина 40% присутствующей в клетке воды образует с глицерином эвтектическую смесь, остальная же ее часть замерзает. Однако, как показали эксперименты, проведенные в 1954–1960 гг. английским криобиологом Одри Смит, золотистые хомячки способны выживать в ситуации, когда в лед превращалось до 50–60% воды, содержащейся в тканях их головного мозга!

Большое значение для решения проблемы обратимого замораживания имеет скорость охлаждения. При медленном охлаждении (в парах жидкого азота или в специальных программных замораживателях) кристаллы льда образуются в основном в межклеточном пространстве. По мере охлаждения они растут, оттягивая на себя воду из клеток. Как уже было сказано, это позволяет существенно уменьшить повреждения, наносимые кристаллами клеткам, – но и концентрация солей внутри клеток значительно возрастает, повышая риск денатурации белков. Большое значение для решения проблемы обратимого замораживания имеет скорость охлаждения. При медленном охлаждении (в парах жидкого азота или в специальных программных замораживателях) кристаллы льда образуются в основном в межклеточном пространстве. По мере охлаждения они растут, оттягивая на себя воду из клеток. Как уже было сказано, это позволяет существенно уменьшить повреждения, наносимые кристаллами клеткам, – но и концентрация солей внутри клеток значительно возрастает, повышая риск денатурации белков. К сожалению, оптимальные скорости понижения температуры, при которых достигается компромисс между повреждающими действиями кристаллов льда и высокими концентрациями растворенных веществ, для разных типов клеток сильно различаются. Различны также и оптимальные для них концентрации криопротекторов. Это сильно затрудняет криосохранение органов и тканей, включающих несколько различных типов клеток, а тем более – целых организмов.

При быстром охлаждении (например, опускании образца в жидкий азот) вода не успевает продиффундировать из клеток наружу; кристаллы образуются как вне, так и внутри клеток, но за счет более быстрого охлаждения они оказываются значительно мельче, чем в первом случае, и успевают образоваться не во всех клетках. Токсичных концентраций солей при этом удается избежать, а продолжительность их воздействия оказывается меньше, как и продолжительность вредного воздействия криопротекторов. Последнее позволяет использовать более высокие их концентрации. При быстром охлаждении (например, опускании образца в жидкий азот) вода не успевает продиффундировать из клеток наружу; кристаллы образуются как вне, так и внутри клеток, но за счет более быстрого охлаждения они оказываются значительно мельче, чем в первом случае, и успевают образоваться не во всех клетках. Токсичных концентраций солей при этом удается избежать, а продолжительность их воздействия оказывается меньше, как и продолжительность вредного воздействия криопротекторов. Последнее позволяет использовать более высокие их концентрации.

При достаточно быстром охлаждении до 0 °С и несколько ниже вода замерзает (кристаллизуется) не сразу. При достаточно быстром охлаждении до 0 °С и несколько ниже вода замерзает (кристаллизуется) не сразу. Сначала образуется переохлажденная жидкость. В упомянутых экспериментах Смит ей в отдельных случаях удавалось охладить золотистых хомячков до –6 °С без образования кристаллов льда. При этом кожа и конечности животных оставались мягкими. А после согревания хомячки оживали без видимых вредных последствий. Беременные самки (если переохлаждение имело место в первой половине срока беременности) приносили нормальных детенышей.

Существует методика проведения хирургических операций на новорожденных детенышах мелких млекопитающих – например, мышатах. Существует методика проведения хирургических операций на новорожденных детенышах мелких млекопитающих – например, мышатах. Наркоз в таком возрасте практически неприменим, и поэтому детенышей в течение 15–20 минут просто охлаждают до потери подвижности и чувствительности. Известен случай, когда при проведении таких исследований (влияние удаления вомероназального органа на поведение грызунов) в лаборатории одного из московских институтов нескольких новорожденных детенышей джунгарского хомячка по небрежности экспериментатора просто забыли лежащими на ватной подстилке в камере с температурой –12 °С. После извлечения – через 2–3 часа – они были совершенно твердыми, и их тела в буквальном смысле «издавали деревянный стук». Через некоторое время при комнатной температуре детеныши ожили, начали двигаться и издавать звуки...

Жидкости в организме начинают замерзать обычно при –1... –3 °С. Однако по мере того, как часть воды превращается в лед, концентрация растворенных веществ в оставшейся жидкости возрастает и температура замерзания этой жидкости продолжает снижаться. Жидкости в организме начинают замерзать обычно при –1... –3 °С. Однако по мере того, как часть воды превращается в лед, концентрация растворенных веществ в оставшейся жидкости возрастает и температура замерзания этой жидкости продолжает снижаться. Температура полного замерзания различных биологических жидкостей сильно варьирует, но в любом случае оказывается ниже –22...–24 °С. Вероятность образования «зародыша» кристалла льда за единицу времени в переохлажденной жидкости пропорциональна объему этой жидкости и сильно зависит от температуры: при –40 °С и при давлении в 1 атм. кристаллизация чистой воды происходит практически мгновенно, но при еще более низких температурах (порядка –70 °С скорость роста кристаллов замедляется за счет увеличения вязкости воды. Наконец, при температуре примерно –130 °С рост кристаллов полностью приостанавливается. Если охлаждать жидкость достаточно быстро, чтобы «проскочить» температуру активной кристаллизации прежде, чем успеют сформироваться кристаллы опасного размера, вязкость возрастает настолько, что образуется твердое стеклообразное вещество. Это явление называется стеклованием или витрификацией.

Если удастся охладить клетки или ткани до температуры стеклования, они смогут сохраняться в таком состоянии неограниченно долго, а полученные при этом повреждения окажутся несравненно меньше, чем при охлаждении с кристаллизацией. Если удастся охладить клетки или ткани до температуры стеклования, они смогут сохраняться в таком состоянии неограниченно долго, а полученные при этом повреждения окажутся несравненно меньше, чем при охлаждении с кристаллизацией. Собственно, это и явилось бы решением проблемы сохранения биологических объектов в состоянии глубокой заморозки. Правда, при оттаивании клеток для их оживления придется снова проходить опасный участок температур...

Еще в 60-е гг. ХХ в. была предложена идея использовать для управления кристаллизацией воды высокое давление. Идея эта основана на понижении температуры фазового перехода вода/лед при повышении давления. При 2045 атм. температура кристаллизации чистой воды составляет –22 °С. Бoльшего снижения температуры замерзания достичь таким образом не удается – при дальнейшем росте давления она начинает вновь повышаться. Еще в 60-е гг. ХХ в. была предложена идея использовать для управления кристаллизацией воды высокое давление. Идея эта основана на понижении температуры фазового перехода вода/лед при повышении давления. При 2045 атм. температура кристаллизации чистой воды составляет –22 °С. Бoльшего снижения температуры замерзания достичь таким образом не удается – при дальнейшем росте давления она начинает вновь повышаться. Еще в 1967 г. американец М.Д. Персидски и его коллеги поставили эксперименты по замораживанию почек собаки. Исследователи подвергали почки перфузии 15%-ным раствором диметилсульфоксида (перфузия – введение веществ в биологический объект через систему кровеносных сосудов), после чего охлаждали их с одновременным повышением давления, так чтобы в каждый конкретный момент температура не была ниже точки замерзания, соответствующей данному давлению. Когда минимальное значение температуры (в данном случае, благодаря присутствию криопротектора оно составило около –25 °С) было достигнуто, давление снижали.

Для того, чтобы кристаллизовалась вся вода, нужно было бы перед снижением давления охладить образец до температуры примерно –80 °С – однако в этом случае лед начал бы образовываться гораздо раньше. М.Персидски решил проблему путем циклического приложения давления. Для того, чтобы кристаллизовалась вся вода, нужно было бы перед снижением давления охладить образец до температуры примерно –80 °С – однако в этом случае лед начал бы образовываться гораздо раньше. М.Персидски решил проблему путем циклического приложения давления. Разогревшийся до 0 °С после первого снятия давления образец начинали охлаждать вновь – одновременно с повторным повышением давления. При очередном его «сбросе» успевала замерзнуть следующая порция жидкости, и т.д. В результате удалось достичь практически полной и «безвредной» кристаллизации воды, после чего температуру можно было уже безбоязненно понизить до –130 °С (и ниже) при обычном атмосферном давлении и сохранять почку в таком состоянии неограниченно долго.

В дальнейшем техника замораживания при высоком давлении использовалась при подготовке биологических образцов для микроскопических исследований. В дальнейшем техника замораживания при высоком давлении использовалась при подготовке биологических образцов для микроскопических исследований. Для того, чтобы сделать достаточно тонкий срез, образец нужно предварительно перевести в твердое состояние, однако при обычной заморозке структуры клеток при этом повреждаются настолько, что изучать оказывается практически нечего...

Конечно, необходимо решить еще целый ряд проблем: в ходе экспериментов отработать оптимальный режим охлаждения, подобрать конкретные криопротекторы и т. д. Конечно, необходимо решить еще целый ряд проблем: в ходе экспериментов отработать оптимальный режим охлаждения, подобрать конкретные криопротекторы и т. д. Например, при прохождении циклов «сжатие с охлаждением – снятие давления» охлаждение происходит только с поверхности объекта. Это приводит к тому, что на периферии лед будет образовываться, тогда как в центре может, наоборот, происходить таяние уже имеющегося льда за счет повышения давления. Бороться с этим можно, как понижая температуру медленнее (и позволяя объекту охлаждаться более равномерно), так и повышая концентрацию веществ-криопротекторов в наружных слоях. При этом не обязательно повышать давление до максимальных значений. Можно, увеличив число циклов, оставаться в пределах заведомо безопасных 500–1000 атмосфер.

Перспективы Так что имеющиеся данные вполне позволяют надеяться на использование высоких давлений для управления кристаллизацией свободной воды и криосохранения крупных биологических объектов-органов и даже целых организмов. Работы в этом направлении ведутся в Институте биофизики клетки РАН (Лаборатория криоконсервации генетических ресурсов под руководством Э.Н. Гаховой) совместно с Институтом биомедицинских технологий и ГосНИИ ВТ им. С.А. Векшинского.