🗊Презентация Обмен нуклеотидов Матричные биосинтезы

Лекция 8. Обмен нуклеотидов Матричные биосинтезы Дисциплина: С.2.Б.5 биологическая химия, биохимия полости рта Специальность: 060201 стоматология НГМУ, кафедра медицинской химии Д.б.н., доцент Суменкова Дина Валерьевна

Актуальность темы Нуклеотиды и их производные выполняют многообразные функции в организме человека: участвуют в синтезе нуклеиновых кислот, нуклеотидных коферментов (NAD, NADP, FAD, FMN), участвуют в образовании активных форм углеводов (УДФ-глюкоза), аминокислот (SAM), «энергетических молекул» (АТФ, ГТФ), участвуют в передаче сигнала гормонов в клетку (цАМФ, цГМФ). Нарушение процессов обмена нуклеотидов лежит в основе патогенеза некоторых заболеваний человека (подагра, мегалобластная анемия, иммунодефицитные состояния). Нуклеиновые кислоты – биомолекулы, участвующие в хранении и передаче наследственной информации. Синтез нуклеиновых кислот и белков (матричные биосинтезы) – основа роста организма. Методы молекулярной биологии – основа современной диагностики и терапии (ПЦР-анализ, генная терапия). В основе механизма действия ряда противовирусных и противоопухолевых препаратов лежит ингибирование процессов синтеза нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

План лекции Образование фосфорибозилдифосфата (ФРДФ) – ключевой момент в синтезе нуклеотидов Синтез и катаболизм пуриновых нуклеотидов: ход процесса, регуляция, «запасные» пути синтеза. Нарушения обмена пуриновых нуклеотидов Синтез и катаболизм пиримидиновых нуклеотидов: ход процесса, регуляция. Нарушения обмена пиримидиновых нуклеотидов Образование дезоксирибонуклеотидов Матричные биосинтезы: репликация, транскрипция, трансляция Синтез нуклеотидов и матричные биосинтезы – мишень действия противоопухолевых, противовирусных и антибактериальных лекарственных препаратов (задание для самостоятельной работы, см. слайд 41 и 72 )

Цель лекции Знать: Основные метаболические пути превращения пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов Химико-биологическую сущность процессов репликации, транскрипции, трансляции Использовать знания об обмене нуклеотидов, синтезе нуклеиновых кислот и белков для понимания механизмов роста и сохранения генома, механизмов возникновения заболеваний, связанных с нарушением изучаемых процессов, механизма действия противоопухолевых, противовирусных и антибактериальных лекарственных препаратов

Вспомните самостоятельно из курса химии, используя слайды 6-14 Пуриновые и пиримидиновые азотистые основания Структура пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. Виды химических связей в нуклеотидах Строение и роль нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) Виды РНК и особенности их строения

Строение нуклеиновых кислот

Пентозы в структуре нуклеиновых кислот Пентозы в структуре нуклеиновых кислот

Первичная структура НК: последовательность нуклеотидов

Вторичная структура ДНК: двойная спираль Правозакрученная спираль (виток = 10 н.п.) Цепи антипараллельны: 5′→3′ и 3′→ 5′ Водородные связи между АО цепей Стэкинг-взаимодействия (гидрофобные) между АО «в стопке» Комплементарность цепей (А-Т, Г-Ц) Правило Чаргаффа: А=Т, Г=Ц, А+Т / C+G – характеристика вида

Третичная структура ДНК: нуклеопротеидные комплексы (хромосомы) Гистоновые белки: белки с высоким содержанием лиз и арг 5 типов: Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4 Негистоновые белки: белки и ферменты, участвующие в матричных биосинтезах Роль белков: обеспечивают суперспирализацию и компактизацию ДНК Нуклеосома ДНК (≈146 н.п.) + 8 молекул гистонов (Н2А, Н2В, Н3, Н4)2 Структура удерживается ионными связями между лиз, арг и остатками Н3РО4 Линкерные участки Участок ДНК (≈30 н.п.) между нуклеосомами, с которым связаны молекулы гистона Н1 Гетерохроматин – «компактный» хроматин, транскрипционно неактивный Эухроматин – деспирализованный хроматин с низким содержанием гистонов и высоким содержанием негистоновых белков (период транскрипции)

Пространственная структура РНК

тРНК

рРНК

Образование фосфорибозилдифосфата (ФРДФ) Продукты расщепления нуклеиновых кислот тканей и пищи используются повторно в незначительной степени. Почти все клетки способны к синтезу нуклеотидов. Образование ФРДФ – центральное место в синтезе пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов Источник образования ФРДФ: рибозо-5-фосфат (продукт ПФП окисления глюкозы) рибозо-5-фосфат + АТФ → 5-фосфорибозил-1-дифосфат + АМФ (ФРДФ синтетаза)

Синтез пуриновых нуклеотидов: основные этапы (см. схему реакций на слайде 17) Сборка пуринового гетероциклического основания осуществляется на ФРДФ при участии глицина, глутамина, аспартата, СО2 и одноуглеродных производных Н4-фолата в цитозоле: формирование 5-членного кольца формирование 6-членного кольца образование первого пуринового нуклеотида – инозинмонофосфата (ИМФ) Синтез ИМФ включает 10 стадий и требует затрат 6 АТФ образование АМФ и ГМФ

Образование АМФ и ГМФ из ИМФ Образование АДФ, ГДФ, ГТФ В образовании АМФ из ИМФ участвует аспартат В образовании ГМФ из ИМФ участвует глутамин Схема реакций представлена на слайде 20. Нуклеозидди- и трифосфаты синтезируются при участии АТФ и киназ: АМФ + АТФ ↔ 2АДФ (аденилаткиназа) ГМФ + АТФ → ГДФ + АДФ (гуанилаткиназа) ГДФ + АТФ → ГТФ + АДФ Внимание! Образование АТФ происходит только путем субстратного и окислительного фосфорилирования

Ферменты синтеза АМФ И ГМФ: подписи к схеме слайда 20. В синтезе АМФ из ИМФ участвуют ферменты: 1 – аденилосукцинатсинтетаза 2 – аденилосукциназа В синтезе ГМФ из ИМФ участвуют ферменты: 3 – ИМФ-дегидрогеназа 4 – ГМФ-синтетаза КМФ – ксантозин-5-монофосфат

Регуляция синтеза пуриновых нуклеотидов Аллостерические ферменты: ФРДФ-синтетаза амидофосфорибозилтрансфераза ИМФ-дегидрогеназа Аденилосукцинатсинтетаза Отрицательные эффекторы: АМФ, ГМФ

Запасные пути синтеза пуриновых нуклеотидов : роль «пути спасения» В период активного роста тканей синтез пуриновых нуклеотидов из простых предшественников не способен полностью обеспечить нуклеиновые кислоты субстратами, поэтому в этих условиях важную роль играют «пути спасения»

Ферменты «пути спасения» в синтезе пуриновых нуклеотидов К слайду 24: 1 – гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза 2 – аденинфосфорибозилтрансфераза 3 - аденозинкиназа

Катаболизм пуриновых нуклеотидов Отщепление фосфата, аминогруппы, рибозы с образованием азотистых оснований гипоксантина и ксантина (см. схему реакций на слайде 27) Терминальный фермент катаболизма: ксантиноксидаза (аэробная дегидрогеназа) Кофакторы: Fe 3+, Мо 2+, FAD Конечный продукт: мочевая кислота образуется в основном в печени и кишечнике выводится с мочой и через кишечник слабая кислота: в биологических жидкостях находится в комплексе с белками или в виде натриевой соли (ураты) в крови: 0,15 – 0,47 ммоль/л (3-7 мг/дл) выводится в сутки: 0,4 – 0,6 г мочевой кислоты и уратов

Ферменты катаболизма пуриновых нуклеотидов К слайду 27: 1 – фосфатаза (нуклеотидаза) 2 – аденозиндезаминаза 3 – пуриннуклеозидфосфорилаза 4 – гуаназа 5 - ксантиноксидаза

Нарушения обмена пуриновых нуклеотидов Дефект генов ферментов гиперактивация или устойчивость ФРДФ-синтетазы к аллостерическим ингибиторам снижение активности гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрнасферазы (уменьшается повторное использование пуринов) Подагра (гиперурикемия, отложение мочевой кислоты в суставах) Аллопуринол (лекарственный препарат) – структурный аналог гипоксантина, используется в лечении подагры. Каков механизм действия препарата? Катаболизм пуринов останавливается на стадии гипоксантина, который лучше растворяется в жидкостях организма, чем мочевая кислота.

Синтез пиримидиновых нуклеотидов Основные этапы синтеза: Формирование пиримидинового кольца (оротата) из глутамина, аспартата, СО2 Взаимодействие оротата с ФРДФ с образованием УМФ Фосфорилирование УМФ Образование ЦТФ из УТФ

Образование оротата и УМФ глутамин + СО2 + 2 АТФ + Н2О → карбамоилфосфат + 2 АДФ + Рi (карбамоилфосфатсинтетаза II) присоединение аспартата (образование карбамоиласпартата), отщепление воды (образование циклического дигидрооротата) Данные реакции катализирует мультиферментный комплекс КАД-фермент: карбамоилфосфатсинтетаза аспартаттранскарбамоилаза дигидрооротаза окисление дигидрооротата при участии NAD-дегидрогеназы с образованием оротата реакция с ФРДФ: перенос фосфорибозила на оротат и декарбоксилирование оротидинфосфата с образованием УМФ (УМФ-синтаза: трансфераза и декарбоксилаза)

Нарушения образования оротата Мутация в гене УМФ-синтазы приводит к нарушению образования УМФ их оротата и вызывает наследственное заболевание, которое сопровождается оратацидурией Клинические проявления: мегалобластная анемия, нарушение работы ЖКТ, сердца, интеллектуальной и двигательной активности Причина проявлений: «пиримидиновый голод»

Фосфорилирование УМФ и образование ЦТФ Фосфорилирование УМФ: образование УТФ УМФ + АТФ → УДФ + АДФ УДФ + АТФ → УТФ + АДФ Реакции катализируют киназы Образование ЦТФ: УТФ + глутамин + АТФ → ЦТФ + глутамат + АДФ +H3PO4 (ЦТФ синтетаза)

Регуляция синтеза пиримидиновых нуклеотидов Аллостерическая регуляция по механизму отрицательной обратной связи: УТФ ингибирует КФС II в составе КАД-фермента УМФ и ЦМФ ингибируют УМФ-синтазу ЦТФ ингибирует ЦТФ-синтетазу

Катаболизм пиримидиновых нуклеотидов Отщепление остатков фосфорной кислоты и рибозы (аналогично катаболизму пуриновых нуклеотидов) Пиримидиновые основания разрушаются ферментными системами: например Цитозин → СО2 + NH3 + бета-аланин Бета-аланин включается в состав карнозина и ансерина (мышечные пептиды)

Образование дезоксирибонуклеотидов Образование дНДФ (А, Г, Ц, У) из НДФ Образование дТМФ из дУМФ Внутриклеточная концентрация дезоксирибонуклеотидов низкая Активность процесса их образования повышается перед делением клеток во время репликации 2 ферментных комплекса: рибонуклеотидредуктаза (восстановление рибонуклеотидов с образованием дезоксипроизводных): рибонуклеотидредуктаза белок-восстановитель тиоредоксин тиоредоксинредуктаза тимидилсинтаза

Регуляция активности рибонуклеотидредуктазного комлпекса Аллостерический фермент Отрицательные эффекторы: дНТФ дАТФ – ингибитор восстановления всех рибонуклеотидов Иммунодефициты: накопление дАТФ, связанное со снижением активности аденозиндезаминазы (фермент реакции гидролитического дезаминирования аденозина) приводит к ингибированию рибонуклеотидредуктазы и лишает клетки-предшественники В и Т-лимфоцитов образования дезоксирибонуклеотидов и синтеза ДНК

Синтез тимидиловых нуклеотидов

Тимидилсинтазный комплекс ферментов 1- Тимидилсинтаза (включение одноуглеродного радикала в дУМФ) 2- Дигидрофолатредуктаза 3- Сериноксиметилтрансфераза (перенос оксиметильной группы с серина на Н4-фолат с образованием метилен-Н4-фолата)

Задание для самостоятельной работы Изучить информацию по теме: «Ферменты синтеза нуклеотидов – мишени действия противоопухолевых и противовирусных препаратов» (см. список литературы) Составить таблицу (препарат – механизм действия – область применения) и охарактеризовать препараты: фторурацил, метотрексат, ацикловир, азидотимидин

Заключение «Обмен нуклеотидов» Большая часть используемых в клетках нуклеотидов синтезируется de novo из простых предшественников (с участием аминокислот, производных фолиевой кислоты). Центральное место в синтезе нуклеотидов занимает образование фосфорибозилдифосфата. «Запасные» пути синтеза (из имеющихся в клетке азотистых оснований и нуклеозидов) играют важную роль в образовании пуриновых нуклеотидов. Нарушение катаболизма пуриновых нуклеотидов лежит в основе патогенеза подагры. Нарушение синтеза пиримидиновых нуклеотидов лежит в основе патогенеза мегалобластной анемии. Механизм действия ряда противовирусных и противоопухолевых лекарственных препаратов связан с нарушением синтеза нуклеотидов (задание для самостоятельной работы).

Литература по теме «Обмен нуклеотидов» 1. Биохимия с упражнениями и задачами: учебник для студентов ВУЗов / ред. С. Е. Северин. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 384 с. (С. 183-191, для выполнения самостоятельной работы «Лекарственные препараты-ингибиторы синтеза нуклеотидов» см. С. 189) 2. Березов Т. Т. Биологическая химия: учебник для студ. мед. вузов / Т. Т. Березов, Б. Ф. Коровкин. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2004. - 704 с. (глава 13, С. 470-478)

Матричные биосинтезы Репликация Транскрипция Трансляция

РЕПЛИКАЦИЯ: синтез ДНК Протекает в ядре в S-фазу клеточного цикла перед митозом Стимулы: гормоны, ростовые факторы, белки-циклины Матрица: обе нити ДНК, образуются 2 репликативные вилки Направление синтеза новых цепей: 5′ - 3′ по принципу комплиментарности и антипараллельности Участки синтеза – ориджины репликации Участок ДНК между соседними ориджинами - репликон Этапы репликации: инициация, элонгация, терминация Субстраты и источники энергии: дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ Кофактор: Mg2+ Полуконсервативный процесс синтеза: каждая дочерняя молекула ДНК содержит одну родительскую нить и одну синтезированную Образуется идентичная молекула ДНК (клетка 4n)

1 этап репликации: инициация

Схема инициации репликации

2 этап репликации: элонгация Синтез новых цепей ДНК Лидирующая цепь: 3′ - 5′ (синтез непрерывный по ходу движения репликативной вилки) Отстающая цепь: 5′ - 3′ (рост этой цепи начинается после того, как на лидирующей цепи синтезируется участок из ≈200 нуклеотидов, синтез идет против движения репликативной вилки в виде фрагментов Оказаки) Синтез цепей начинается с образования «затравки» (РНК-праймера из ≈10 нуклеотидов) Ферменты: ДНК-полимераза α синтезирует РНК-праймер и небольшой участок ДНК ДНК-полимераза δ удлиняет лидирующую цепь ДНК-полимераза δ или ε удлиняют отстающую цепь

3 этап репликации: терминация Исключение праймеров Завершение формирования отстающей цепи ДНК Эндонуклеаза (РНКаза) удаляет РНК-праймер ДНК-полимераза β заполняет «брешь» ДНК-лигаза объединяет фрагменты, затрачивая энергию АТФ

Схема репликативной вилки

Репарация ошибок и повреждений ДНК Причина повреждений ДНК: действие факторов окружающей и внутренней среды Повреждение ДНК происходит с частотой от нескольких сотен до 1000 случаев в каждой клетке, каждый час Виды повреждений: дезаминирование АО (цитозин превращается в урацил), метилирование АО депуринизация, депиримидинизация образование пиримидиновых димеров (действие УФО) разрыв цепей, ковалентные сшивки между цепями ошибки репликации Система репарации – ферменты (нуклеазы, полимеразы, лигазы)

Схема работы системы репарации ДНК

Роль системы репарации Репарация необходима для сохранения генома и возможна благодаря существованию 2-х цепей ДНК Снижение активности ферментов репарации приводит к накоплению мутаций Полагают, что от 80 % до 90 % всех раковых заболеваний связаны с нарушением репарации ДНК ПРИМЕР: пигментная ксеродерма – наследственное заболевание, связанное с мутацией генов системы репарации ДНК; УФО таких больных приводит к накоплению мутаций в клетках кожи и развитию рака

ТРАНСКРИПЦИЯ: синтез РНК Протекает в ядре вне зависимости от фаз клеточного цикла Матрица: нить ДНК 3′ - 5′ Субстраты и источники энергии: АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ Направление синтеза: 5′ - 3′ по принципу комплиментарности и антипараллельности Этапы: инициация, элонгация, терминация Участвуют факторы инициации, элонгации и терминации Образуются комплиментарные матрице продукты: мРНК, тРНК, рРНК Ферменты: РНК-полимераза I (синтез пре-рРНК) РНК-полимераза II (синтез пре-мРНК) РНК-полимераза III (синтез пре-тРНК)

1 этап транскрипции: инициация Промотор – последовательность ДНК (ТАТА), с которой связывается РНК-полимераза Сайт терминации – участок завершения синтеза РНК Транскриптон – участок ДНК ограниченный промотором и сайтом терминации «Активация» промотора с помощью ТАТА-фактора Взаимодействие промотора с РНК-полимеразой и факторами инициации Факторы инициации обеспечивают расплетение двойной нити ДНК длиной в один виток (10 н.п.)

2 этап транскрипции: элонгация и терминация Элонгация: рост нити пре-РНК Факторы элонгации (E, H, F) повышают активность РНК-полимеразы и облегчают расхождение цепей. Один ген может одновременно транскрибироваться несколькими молекулами РНК-полимеразы Терминация: прекращение транскрипции Факторы терминации облегчают отделение пре-РНК и РНК-полимеразы от матрицы ДНК

Схема транскрипции

Посттранскрипционные модификации пре-РНК «Созревание» пре-мРНК «Кэпирование» на стадии элонгации Образование поли(А)- «хвоста» после транскрипции Сплайсинг – удаление интронов (некодирующих последовательностей) и соединение экзонов Участвуют малые ядерные рибонуклеопротеины (мяРНП), образующие комплексы – сплайсосомы Выход «зрелой» мРНК в цитоплазму Альтернативный сплайсинг – механизм образования различных видов «зрелой» мРНК из одной и той же молекулы пре-мРНК в разных тканях В результате в разных тканях при считывании информации с одного и того же гена образуются различные мРНК, а соответственно и различные белки

Схема «созревания» пре-мРНК

«Созревание» пре-тРНК

«Созревание» пре-рРНК

ТРАНСЛЯЦИЯ: синтез белка

Свойства биологического кода Триплетность Наличие терминирующих кодонов (UAA, UAG, UGA) Специфичность Вырожденность Универсальность Однонаправленность Колинеарность

Активация аминокислот

1 этап трансляции: инициация

2 этап трансляции: элонгация (рост пептидной цепи) Стадии элонгации: Связывание аа-тРНК в А-центре при участии фактора элонгации EF1 и с затратой энергии ГТФ Образование пептидной связи между АК Р-центра и АК А-центра при участии пептидилтрансферазы Перемещение рибосомы по мРНК (транслокация) в направлении от 5′- к 3′-концу с использованием энергии ГТФ и при участии фактора элонгации EF2 Многократное повторение стадий

3 этап трансляции: терминация

Посттрансляционные модификации белков – образование функционально активных белков Частичный протеолиз Фолдинг – формирование пространственной структуры (II, III) при участии белков-шаперонов Модификация аминокислот (гликозилирование, фосфорилирование, ацилирование, метилирование……) Образование дисульфидных связей (цистеин-цистеин) Присоединение простетической группы (сложные белки) Сборка протомеров в олигомерные белки (формирование IV структуры)

Регуляция матричных биосинтезов Экспрессия генов — процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок Гены белков «домашнего хозяйства» (конститутивные) экспрессируются с постоянной скоростью и обеспечивают жизнеспособность клеток (например, гены ферментов энергетического обмена)

Адаптивная регуляция обеспечивает изменение скорости экспрессии генов в ответ на меняющиеся условия среды (индуцибельная экспрессия). Осуществляется при участии: регуляторных белков, взаимодействующих с участками ДНК индукторов (стимулируют экспрессию) или корепрессоров (подавляют экспрессию) Индукторы или корепрессоры стимулируют присоединение регуляторных белков к регуляторным участкам ДНК В качестве индукторов и корепрессоров выступают гормоны, ростовые факторы, продукты метаболических путей Регуляторные участки ДНК: Энхансер – «усилитель» транскрипции Сайленсер – «тушитель» транскрипции ПРИМЕР: ХОЛЕСТЕРИН (как корепрессор) → БЕЛОК-РЕГУЛЯТОР → САЙЛЕНСЕР → ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГМГ-КоА-РЕДУКТАЗЫ (ключевой фермент синтеза холестерина) → СНИЖЕНИЕ СИНТЕЗА ХОЛЕСТЕРИНА

Примеры ингибиторов матричных биосинтезов Токсин белой поганки аманитин ингибирует РНК-полимеразу II (синтез мРНК) Энтеротоксин возбудителя дифтерии ингибирует трансляцию, модифицируя фактор элонгации EF2 и нарушая транслокацию рибосом Интерфероны (гликопротеины лимфоцитов и макрофагов, обладающие противовирусной активностью): активируют РНК-азу, расщепляющую мРНК и рРНК стимулируют синтез протеинкиназы, которая фосфорилирует и тем самым инактивирует фактор инициации трансляции IF2 прекращается синтез белков в инфицированных клетках человека, клетка погибает, но останавливается размножение вирусов

Задание для самостоятельной работы Изучить информацию по теме: «Лекарственные препараты - ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот и белка» (см. список литературы) Составить таблицу (препарат – механизм действия – область применения) и охарактеризовать препараты: доксорубицин, циклофосфан, фторхинолоны, рифамицины (ингибиторы репликации и транскрипции), тетрациклин, эритромицин, левомицетин (ингибиторы трансляции) Охарактеризовать метод ПЦР-диагностики (см. список литературы)

Заключение «Матричные биосинтезы» Процессы репликации, транскрипции, трансляции (матричные биосинтезы) лежат в основе «производства» белков и ферментов, функционирование которых является основой жизни Регуляция данных процессов лежит в основе адаптации организма Нарушение данных процессов приводит к развитию заболеваний Знания о нуклеиновых кислотах и механизмах матричных биосинтезов являются основой создания лекарственных препаратов, методов диагностики с использованием ДНК-технологий (ПЦР-диагностика) и методов терапии (генная терапия)

Литература по теме «Матричные биосинтезы» Биологическая химия: учебник для студ. мед. вузов / Т. Т. Березов, Б. Ф. Коровкин. - 3-е изд., перераб.и доп. - М.: Медицина, 2004. - 704 с. (глава 3, 13 и 14) Биохимия с упражнениями и задачами: учебник для студ. мед. вузов / ред. Е. С. Северин. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 384 с. (раздел 3, С. 54-79; для выполнения самостоятельной работы «Лекарственные препараты-ингибиторы матричных биосинтезов» и «ПЦР-диагностика» см. С. 70, 73-77)