🗊Презентация Вестерн блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, Western bloting)

Вестерн блоттинг Профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии, Д.м.н. Спирина Людмила Викторовна

Определение. Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, Western bloting)  аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце.

Определение. Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, Western bloting) 

Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории Джорджа Старка (Стенфорд, Великобритания)

протокол. ПРОТОКОЛ 1. Разделение белков методом SDS-PAGE гель-электрофореза/ С помощью гель-электрофореза белки разделяются в полиакриламидном геле. 2. Перенос белков на мембрану 3. Блокирование и Детекция Затем их детектируют с использованием антител: сначала белки связываются с первичными (моно- или поликлональными) антителами, которые в свою очередь связываются со вторичными антителами, конъюгированными с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой).

протокол. Вестерн-блоттингом  можно обнаруживать антиген в количествах менее 1нг. 4. Визуализация. Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков и специфичности моноклональных антител. Визуализация исследуемого белка достигается путем проведения соответствующей биохимической реакции с образованием продукта, который определяется колориметрическим,хеми-люминесцентным, флюоресцентным методами детекции.  

5. Анализ. Количество белка оценивается с помощью денситометрии. 

Southern Blotting Этим методом выявляют уникальные фрагменты ДНК, размер которых составляет приблизительно одну миллионную часть геном Геномную ДНК (обычно выделенную из лейкоцитов или клеток плода) расщепляют на короткие фрагменты, разделяют их в агарозном геле, переносят на мембрану, после чего идентифицируют специфические участки с помощью гибридизации с олигонуклеотидными зондами.

Nothern Blotting Аналог Southern Blotting. Этот метод позволяет выявить специфическую мРНК и оценить ее размер.

Eastern Blotting (является продолжением метода Вестерн блоттинг)

Определение метода Вестерн Блоттинг Метод основан на комбинации гель-электрофореза и иммунохимической реакции «антиген-антитело».

«Твердая фаза» для иммуноблота пористые материалы типа нитроцеллюлозы (PVDF) в виде наполнителей в объеме или в виде плоских листов или полосок стрипов (англ. strip); стрипы используют в методиках типа иммуноблота и иммунохроматографии; в пористых материалах существенно больше площадь, на которой сорбирован один из участников взаимодействия; другие реагенты диффундируют по порам.

Типы твердой фазы для Вестерн блоттинга

Подготовка образца Образец может быть взят из цельной ткани или из клеточной культуры. В большинстве случаев, твёрдые ткани сначала измельчаются механически с использованием блендера (для образцов большого объёма), с использованием гомогенизатора (меньшие объемы), или обработки ультразвуком. Различные детергенты детергенты, соли и буферы могут быть применены для улучшения лизиса клеток и растворения белков. Ингибиторы протеаз и фосфатаз часто добавляются для предотвращения расщепления образцов их собственными ферментами. Подготовка тканей часто выполняется при низких температурах, чтобы избежать денатурации белка.

Гель-электрофорез. Наиболее распространенный способ разделения белков — электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS по Лэмми 

Гель-электрофорез  SDS вызывает денатурацию белков и поддерживает их в денатурированном состоянии, для разрушения вторичных и третичных структур белков используют восстановители дисульфидных связей

Гель -электрофорез Подлежащие анализу белки в присутствии додецилсульфата натрия приобретают одинаковый отрицательный заряд, что делает возможным их разделение в зависимости только от молекулярной массы.

Принцип электрофореза

Принцип электрофореза

Окрашивание гелей Для визуализации результатов электрофореза чаще всего используют окрашивание белков в гелях красителем Кумасси или серебром

Анализ электрофоретического разделения белков В большинстве случаев результаты электрофоретического разделения достаточно получить путем визуальной оценки геля. Однако, с целью получения достоверных данных и надлежащего документирования результатов гель сканируют на просвет при помощи высокочувствительного денситометра, что позволяет надежно определять не только положение белков в геле, но и оптическую плотность белкового пятна.

Анализ электрофоретического разделения белков, Блоттинг С помощью специального программного приложения можно определить такие параметры как электрофоретическая подвижность белка, его чистота, количество белка в пятне и др. Чаще используют хемилюминесцентную систему детекции белков – использование рентгеновских пленок (Блоттинг)

Применение системы визуализации для WB (см. ниже)

Анализ электрофоретического разделения белков Определение молекулярной массы исследуемого белка предполагает необходимость калибровки геля по молекулярным массам. Калибруют гель относительно молекулярных масс белков-маркеров, которые разделяют параллельно с исследуемым образцом.

Выбор % разрешающего геля. концентрация акриламида определяет разрешающую способность геля — чем выше концентрация акриламида, тем лучше разделение низкомолекулярных белков. Низкая концентрация акриламида улучшает разрешающую способность гель-электрофореза для высокомолекулярных белков.

Перенос на мембрану Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской геля переносят на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или  PVDF. Мембрана накладывается поверх геля, а поверх неё кладут стопку фильтровальной бумаги. Метод переноса белков называется электроблоттингом и использует электрический ток, который переносит белки из геля на мембрану. Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. В результате этого «промакивания» (blotting) процесса белки удерживаются на тонком поверхностном слое мембраны для детекции. Оба варианта мембран используют из-за их свойства неспецифично связывать белки. Связывание белков основано как на гидрофобных взаимодействиях, так и на электростатических взаимодействиях между мембраной и белком. Нитроцеллюлозная мембрана дешевле PVDF, но гораздо более хрупкая и хуже выдерживает повторное нанесение меток.

Виды электроблоттинга Сухой Влажный Полусухой (semidry)

Окрашивание белков на фильтре

Подтверждение переноса белков на фильтр (окраска Ponceus)

Блокирование Как только выбрана мембрана, выбраны антитела и целевой белок, должны быть приняты меры по исключению взаимодействия между мембраной и антителом, используемым для детекции целевого белка (ибо антитело само по себе белок). Блокирование неспецифичных связываний достигается помещением мембраны в разбавленный раствор белка — обычно это бычий сывороточный альбумин или нежирное сухое молоко или желатин с небольшим процентом детергента типа Tween-20.

Механизм блокирования

Детекция. Непрямой и прямой WB

Детекция. Следующим этапом является реакция связывания исследуемого белка со специфическим антителом (первичным). Раствор антител и мембрана могут быть вместе закрыты и инкубированы от 30 минут до оставления на ночь. Также они могут быть инкубированы при различных температурах, при повышенной температуре наблюдается лучшее связывание. После удаления несвязавшихся первичных антител, мембрану выдерживают со вторичными антителами и в соответствии с их целевыми свойствами, как правило называются по типу «anti-mouse», «anti-goat».

Антитела для вестерн блоттинга. Механизм детекции. Антитела получают из животного источника и связываются с большинством первичных антител. Вторичные антитела обычно связывают щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена. Наиболее распространенные, связанные с пероксидазой хрена вторичные антитела используются для разрезания хемилюминесцентного агента, и продукт реакции производит люминесцентное излучение пропорционально количеству белка.

Детекция. Другие методы детекции. Другой метод детекции вторичными антителами использует антитела со связанным флюорофором, который излучает в ближней инфракрасной области (NIR). Свет, излучаемый флюоресцентным красителем, постоянен и делает флюоресцентную детекцию более точным и чувствительным способом измерения разницы в сигнале, производимом белками, которые мечены антителами, на вестерн блоте.

Детекция. Другие методы детекции. Третий альтернативный метод использует радиоактивную метку вместо фермента, связанного с вторичным антителом (с радиоактивным изотопом йода). Другие методы безопаснее, быстрее и дешевле, поэтому радиоактивная детекция используется редко.

Визуализация.

Представление фильма Stain free technology

Анализ и представление результатов. На практике, не во всех вестернах обнаруживают белки лишь по одному бэнду на мембране. Приблизительный размер вычисляют сравнивая окрашенные бэнды с маркерами молекулярной массы, добавленными при электрофорезе. Процесс повторят с структурными белками, такими как актин или тубулин, которые не меняют между экспериментами. Количество целевого белка зависит от количества контрольного структурного белка между группами. Этот прием обеспечивает коррекцию количества общего белка на мембране в случае ошибки или неполного переноса.

Анализ и представление результатов. Использование программного приложения Image J. Программного приложение Bio-Rad

ИГХ Иммунная флюоресценция

Применение метода Вестерн-блоттинг используется в молекулярной биологии, биохимии, генетике и в других естественно-научных дисциплинах. В медицине: диагностика ВИЧ (СПИД), болезнь лайма,Helicobacter Pylori, вирус Эпштейн-Барр

Полный протокол 1. электрофорез 2. перенос 3. блокирование 4. инкубация с первичным антителом 5.отмывка 6.инкубация со вторичным антителом 7. отмывка 8. обработка хемилюминесцентной системой детекции 9. детекция с помощью рентгеновской пленки 10. анализ

Применение в практической медицине Подтверждение инфицированности ВИЧ Диагностика клещевого боррелиоза (болезнь Лайма) Диагностика сибирской язвы Диагностика токсоплазмоза (Т);  группу инфекций – гепатиты, сифилис, хламидиоз, листериоз и др. (О);  краснуху (R);  цитомегаловирусную инфекцию (С);  герпес (Н). Вирус Эпштейн-Барр