🗊Презентация ПЦР. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences

ПЦР

1985 Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Cetus Corporation, Department of Human Genetics, Emeryville, CA 94608.

PCR: Polymerase Chain Reaction Позволяет синтезировать большое количество фрагментов ДНК in vitro в ходе циклического энзиматического синтеза ДНК Наиболее популярный и широко распространенный метод молекулярной биологии

1. простой 1. простой 2. высоко чувствительный 3. воспроизводимый 3. быстрый

Почему полимеразная?

Почему цепная?

ПЦР Синтезирует большое количество ДНК(μg) из очень маленьких исходных количеств (fg) [количество исходной матрицы возрастает в миллиард раз] Способна амплифицировать 1 уникальный фрагмент ДНК, находящийся в смеси молекул ДНК [ Геном человека можно представить как смесь из 12 миллионов фрагментов ДНК длиной 300 пар]

Exponential Amplification

Компоненты ПЦР реакции ДНК матрица Праймеры Термостабильная полимераза Taq Polymerase dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) PCR Buffer (mg++) Амплификатор

Термостабильные ДНК полимеразы Поскольку в ходе ПЦР смесь регулярно подвергается воздействию высокой температуры, необходимо использовать термостабильную ДНК полимеразу Taq DNA полимеразу впервые выделили из бактерии Thermus aquaticus в 1976 Taq обладает максимальной ферментативной активностью при 72C - 80 C, и слабо активна при комнатной температуре

Шаг1. Денатурация ДНК

Шаг 2. Гибридизация или отжиг праймеров

Шаг 3. Удлинение

Следующий цикл начинается с денатурации ДНК, синтезированной в предыдущем цикле Следующий цикл начинается с денатурации ДНК, синтезированной в предыдущем цикле

Размер ДНК фрагмента, синтезированного в ПЦР зависит от расстояния между праймерами ПЦР амплифицирует фрагмент ДНК, находящийся между двумя праймерами Если последовательность генома известна, можно выбрать любые праймеры и с помощью ПЦР синтезировать любой фрагмент ДНК этого организма

Фрагмент ДНК между праймерами удваивается каждый цикл ПЦР Например, после 5 циклов ПЦР с одной молекулы ДНК образуется 25 (64) копий выбранного участка. Если в реакцию берется 1 молекула ДНК проводят 40 циклов. В итоге должно получиться 240 (1099511627776) копий выбранного участка

More about Primers PCR primers are short, single stranded DNA molecules (15-40 bp) They are manufactured commercially and can be ordered to match any DNA sequence Primers are sequence specific, they will bind to a particular sequence in a genome DNA polymerase requires primers to initiate replication

Специфичность праймеров

ПЦР и болезни Праймеры могут быть подобраны так, что будут связываться и амплифицировать только определенные варианты генов или мутации в генах. Это возможность лежит в основе генетического консультирования и используется как часть диагностических тестов. Некоторые заболевания могут быть легко диагностированы с помощью ПЦР

Human Immunodeficiency Virus (HIV) HIV is a retrovirus that attacks the immune system. HIV tests rely on PCR with primers that will only amplify a section of the viral DNA found in an infected individual’s bodily fluids. Therefore if there is a PCR product, the person is likely to be HIV positive. If there is no PCR product the person is likely to be HIV negative. Protein detection based tests are available as well but all US blood is tested by PCR.

Viral Replication First step, HIV attaches to susceptible host cell. Site of attachment is the CD4 antigen found on a variety of cells helper T cells macrophages monocytes B cells microglial brain cells intestinal cells T cells infected later on.

HIV (arrows) Infecting a T-lymphocyte

Life Cycle (a) HIV (red) attaches to two cell-surface receptors (the CD4 antigen and a specific chemokine receptor). (b) The virus and cell membrane fuse, and the virion core enters the cell. (c) The viral RNA and core proteins are released from the virion core and are then actively transported to the nucleus. (d) The viral RNA genome is converted into double-stranded DNA through an enzyme unique to viruses, reverse transcriptase (red dot). (e) The double-stranded viral DNA moves into the cell nucleus. (f) Using a unique viral enzyme called integrase, the viral DNA is integrated into the cellular DNA. (g) Viral RNA is synthesized by the cellular enzyme RNA polymerase II using integrated viral DNA as a template. Two types of RNA transcripts shorter spliced RNA (h) and full-length genomic RNA (j) are produced. (h) Shorter spliced RNAs are transported to the cytoplasm and used for the production of several viral proteins that are then modified in the Golgi apparatus of the cell (i). (j) Full-length genomic RNAs are transported to the cytoplasm (k). (l) New virion is assembled and then buds off. (m) Mature virus is released.

Применение ПЦР в криминалистике Установление родственных связей Идентификация личности, в том числе и частей тела (Всемирный торговый центр, войны, теракты). В прошлом году 300 в истории США заключенный был реабилитирован после того, как анализ ДНК показал, что он был признан виновным по ошибке.

Предимплантационная генетическая диагностика (ПГД) дает возможность проводить генетические анализы эмбриону (дизайнерские дети) Впервые ПГД была проведена в Англии в 1989 г. Позволяет выявить более 100 заболеваний (в том числе онкомаркеры, предрасположенность к болезни Альцгеймера, диабету и т.д.), наследственные заболевания. может использоваться для выбора эмбриона, который будет совместимым донором стволовых клеток для лечения больного брата.

PGD может также использоваться для тестирования других признаков, таких как пол, цвет волос, поведение (дизайнерские дети), но эти тесты вызывают ряд этических проблем и не разрешаются во многих странах. Ранний и хорошо известный случай гендерного отбора имел место в 1996 году, когда Моник и Скотт Коллинз в Институте генетики и ЭКО в Фэйрфаксе, штат Вирджиния заказали девочку, так как их первые двое детей были мальчиками, и пара хотела иметь дочь в семье. Это был один из первых широко разрекламированных случаев ПГД, в котором выбор эмбриона выполнялся не для решения конкретных медицинских проблем, а чтобы удовлетворить желание родителей создать более сбалансированную семью.