🗊Презентация Возможности ПЦР-анализа в диагностике пневмоний, гриппа и ОРЗ

Возможности ПЦР-анализа в диагностике пневмоний, гриппа и ОРЗ

Пневмонии Заболеваемость пневмониями в развитых странах составляет 3,6 - 16 на 1000 человек Пневмонии занимают 4 – 5-е место в структуре причин смерти после сердечно-сосудистой патологии, онкологических заболеваний, цереброваскулярной патологии и хронических обструктивных заболеваний легких Среди инфекционных болезней – 1-е место Заболеваемость в возрастной группе старше 60 лет: 20 - 44 на 1000 населения в год. Летальность от пневмоний у данной категории больных - 10 – 33% Высокая летальность от пневмонии среди новорожденных и маленьких детей и достигает 25% у детей младше 5 лет Уровень смертности детей до 1 года в нашей стране в 2 – 4 раза выше (25,1 на 1000 населения), чем в других экономически развитых странах

Смертность детей до 5 лет от пневмонии

Причины неудач в установлении этиологии пневмоний Отсутствие микробного исследования Неправильный сбор материала Возбудитель неизвестен Предшествующее лечение антибиотиками (до взятия материала) Неопределенное клиническое значение выделенного возбудителя Использование неадекватного метода лечения

Классификации пневмоний По характеру приобретения: внебольничная пневмония (ВП) нозокомиальная (внутрибольничная) пневмония Классификация ВП, учитывающая состояние иммунологической реактивности организма пациента: - типичная ВП (у пациентов с отсутствием выраженных нарушений иммунитета) - ВП у пациентов с выраженными нарушениями иммунитета (СПИД, онкогематологические заболевания и др.)

Пневмококковая пневмония Streptococcus pneumoniae является самым частым бактериальным возбудителем ВП Пневмококковые пневмонии регистрируются у пациентов любого возраста, чаще регистрируется среди пациентов с хроническими заболеваниями

Культуральный метод в диагностике пневмококковой пневмонии Материал для исследования: мокрота, венозная кровь, инвазивные респираторные образцы, плевральная жидкость Необходимость оценки качества доставленного образца Критерии пригодности мокроты для бактериологического исследования: ˃25 сегментоядерных лейкоцитов и не более 10 эпителиальных клеток в п/з Обнаружение грамположительных кокков (чаще - ланцетовидные диплококки) d=0,5 - 1,25 мкм, не имеющих спор и жгутиков

Культуральный метод в диагностике пневмококковой пневмонии Чаще используют питательные среды: обогащенные дефибринированной кровью животных (5 %) обогащенные дефибринированной кровью человека шоколадный агар Инкубация в атмосфере с повышенным

Иммунохроматографический тест Выявление пневмококкового клеточного полисахаридного антигена в моче Возможность использования «у постели больного» Пневмококковый экспресс-тест демонстрирует приемлемую чувствительность (50 - 80 %) и достаточно высокую специфичность (> 90 %) Возможность получения ложноположительных результатов при пневмококковом носительстве

ПЦР в диагностике пневмококковой пневмонии В качестве мишеней для амплификации используются гены, кодирующие факторы патогенности: - аутолизин (lytA) пневмококковый поверхностный антиген (psaA) пневмолизин (ply) пневмококковый поверхностный протеин А (PspA) марганец-зависимая супероксид-дисмутаза (sodA) поверхностный пенициллин-связывающий белок 2b (Pbp2b) Spn9802 и Spn9828 Данные методы пока не получили распространения в клинической практике Возможность использования мультиплексной ПЦР

Пневмония, вызванная Mycoplasma pneumoniae Периодичность эпидемий с интервалами от 3 до 7 лет Распространению инфекции способствует частота и длительность контактов среди лиц, пребывающих в закрытых и полузакрытых коллективах Только в 3 - 10 % случаев микоплазменной инфекции рентгенологически диагностируется пневмония Диагностика микоплазменной пневмонии только на основании клинических или рентгенологических данных невозможна - не имеет патогномонических черт Необходимость лабораторной этиологической диагностики

Диагностика микоплазменной пневмонии обнаружение ДНК М. pneumoniae методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выявление антигена микоплазм в реакции прямой иммунофлуоресценции (РИФ) серологические исследования по обнаружению специфических антител класса IgM и IgG к M. pneumoniae в сыворотках крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) Культуральный метод не рекомендован

Диагностика пневмонии, вызванной Chlamydophila pneumoniae С. pneumoniae - патогенная для человека грамотрицательная бактерия с облигатным внутриклеточным типом паразитирования Вызывает пневмонии различной тяжести, длительно протекающие бронхиты, фарингиты, синуситы Пневмония, вызванная С. рneumoniae, обычно имеет благоприятное течение Микст-инфекция осложняет течение заболевания и увеличивает риск летального исхода Частота заболеваемости хламидийной пневмонией выше у детей школьного возраста Эпидемические вспышки происходят каждые 4 - 10 лет Ни один из известных в настоящее время методов диагностики хламидийной пневмонии не обеспечивает 100 %-ю надежность выявления возбудителя

Культуральный метод: Культуральный метод: Длительность и трудоемкость процесса Низкая чувствительность Доступность только специализированным лабораториям Но в случае выделения жизнеспособного возбудителя диагноз может быть поставлен с наибольшей достоверностью без необходимости применения подтверждающих тестов При персистентной инфекции возбудитель переходит в некультивируемое состояние Серологический метод: применяют для ретроспективной диагностики и ретроспективного анализа природы эпидемических вспышек Для обнаружения специфических IgM-, и IgG-антител используют метод иммуноферментного анализа (ИФА) или реакцию иммунофлюоресценции (РИФ)

ПЦР-диагностика Chlamydophila pneumoniae Наиболее специфичный и чувствительный метод выявления возбудителя Но метод не дает возможность дифференцировать острую и хроническую инфекцию Рекомендован биологический материал, полученный из нижних дыхательных путей

Основные источники легионеллезной инфекции: Система водоснабжения; Системы генерирующие аэрозоль: 1. централизованные системы кондиционирования воздуха 2. бассейны, ванны с циркулирующей под давлением водой (типа джакузи) 3. другие (увлажнители воздуха, фонтаны; любое оборудование, распыляющее водный аэрозоль)

Клинические формы

Диагностика

Преимущества ПЦР-анализа Быстрота (от 5 до 8 часов) Специфичность (зависит от мишени, характеристик тест-сиcтемы и способа детекции) Большая чувствительность по сравнению с бактериологическим анализом Возможность быстрой идентификации L.pneumophila с обнаружением всех серогрупп (зависит от характеристик т/c)

Легионеллез - область применения ПЦР-анализа

Диагностика пневмоцистоза Возбудитель - Pneumocystis jiroveci Пневмоцисты тропны исключительно к легочной ткани Группами риска в отношении инфицированности Pneumocystis jiroveci являются: - дети недоношенные, ослабленные новорожденные и дети раннего возраста с гипогаммаглобулинемией, гипотрофией и рахитом больные лейкозом, онкологические больные, реципиенты органов, получающие иммунодепрессанты больные туберкулезом, цитомегалией и другими инфекциями - ВИЧ-инфицированные

Диагностика пневмоцистоза Паразитологический метод (импрегнация метенамин-серебряным нитратом по Гомори, окраска толуидиновым синим, гематоксилином и эозином, по Грамму и раствором Шиффа, методом Романовского-Гимза) Иммунологический метод (иммунофлюоресцентный метод (РИФ) для выявления цист и трофозоитов, выявление специфических антител классов IgG и IgM (ИФА)) ПЦР-диагностика

Регистрируемые в РФ формы ОРЗ и потенциальные возбудители

Методы диагностики ОРВИ, применяемые на территории РФ

Рекомендуется брать материал как можно раньше от момента появления симптомов, при госпитализации - в первые сутки

Как правильно держать зонды

Мазки из носоглотки

Мазки из ротоглотки

Этиологическая расшифровка ОРЗ методом ПЦР (Москва, ФГУН ЦНИИЭ)

Высокоэффективна для этиологической диагностики ОРЗ спорадического и вспышечного характера Высокоэффективна для этиологической диагностики ОРЗ спорадического и вспышечного характера Использование ПЦР позволит уточнить долю типичных бактериальных возбудителей в этиологической структуре пневмоний и изучать роль вирусных агентов и вирусно-бактериальных ассоциаций в патогенезе ОРЗ Внедрение ПЦР позволит избежать часто необоснованного применения антибиотиков при ОРВИ, и своевременно назначать специфическую терапию при инфицировании бактериальными возбудителями ОРЗ Перспективы изучения этиологии хронических заболеваний дыхательных путей (бронхиальной астмы, ХОБ, ХОБЛ)

ПЦР тест-системы, производимые в ЦНИИЭ АмплиСенс®

Характеристика основных возбудителей ОРЗ

Бокавирус человека Открыт в 2005 году Зарегистрирована высокая распространенность (6 годам все дети имеют антитела к бокавирусу человека) Доказательcтво инфекционности: - зарегистрировано выявление ДНК возбудителя в назофарингеальных мазках и в крови с одновременным повышением титра антител > 10 раз у пациентов с ОРЗ нижних отделов респираторного тракта Вирусная ДНК обнаруживается также в фекалиях, сыворотке, моче

Коронавирусы – возбудители ОРЗ

SARS/ТОРС: хронология событий

Циветты – источник вируса ТОРС для человека

РТ-ПЦР РНК вируса SARS-CoV (<7 дней) РТ-ПЦР РНК вируса SARS-CoV (<7 дней) Серология ИФА IgM и IgG (≥2 недели) специфичность - 95% IgM в ИФА сохраняется более 4 недель

Вирусы гриппа - классификация

Грипп A Вызывает эпидемии и пандемии, ежегодно в мире: 600 млн случаев заболеваний, 150 - 200тыс случаев госпитализаций, 250-500тыс летальных исходов, Субтипы гриппа A отличающиеся по сочетанию двух поверхностных гликопротеинов: Гемагглютинин (HA) = 16 типов Нейраминидаза (NA) = 9 типов Все субтипы вируса А циркулируют среди диких птиц Сезонный грипп: только субтипы H1N1, H3N2 циркулируют среди людей в настоящее время

Мутационный процесс вируса гриппа А Антигенный дрейф (Незначительные изменения HA/NA) Точечные мутации во время репликации, подтип остается тем же Следствия: Постоянные изменения антигенных свойств Ежегодные эпидемии Необходимость ежегодного обновления вакцин

Пандемии гриппа в ХХ веке и в ХХI веке….

Вирус гриппа A/H5N1 Вирус может присутствовать у инфицированной птицы во всех органах и частях Выживание в фекалиях: 35 дней при 4°C/6 дней при 37°C Выживание в птичниках: Несколько недель Только тщательная термическая обработка позволяет инактивировать вирус Замораживание/охлаждение неадекватны Яйца инфицированной птицы могут быть контаминированы как изнутри так и снаружи скорлупы (кипячение не менее 10 минут)

Пандемия гриппа 2009г (A/H1N1)

Динамика заболеваемости и смертности

Лабораторная диагностика: рекомендации Центра по контролю и профилактике заболеваний CDC США ПЦР с использованием валидированных протоколов Изоляция вируса в культуре MDCK или на куриных эмбрионах с последующим секвенированием генома (окончательная идентификация) Не рекомендуются быстрые тесты по обнаружению антигенов гриппа А: иммунофлуоресценция, иммунохроматография, в связи с низкой чувствительностью (от 40 до 60%) и отсутствием специфичности определения «свиного» штамма

Спасибо за внимание! Спасибо за внимание!