🗊Презентация Современные проблемы диагностики сепсиса

СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ диагностики сепсиса Ольга Филипповна Сибирева, доктор медицинских наук, профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии СибГМУ Минздрава России

План лекции 1. Что такое сепсис? 2. Диагностические критерии сепсиса 3. Критерии органной дисфункции сепсиса 4. Достоинства и недостатки прокальцитонинового теста 5. Пресепсин-маркер диагностики сепсиса 6. Микробиологическая диагностика сепсиса 7. Проточная цитофлюориметрия, как метод ранней диагностики сепсиса

Что такое сепсис? Сепсис -это инфекция, предполагаемая или подтвержденная, в сочетании с несколькими критериями ССВО, потенциально смертельное состояние, вызываемое избыточным иммунным ответом на возбудителя инфекции, что может повлечь за собой системную воспалительную реакцию во всем организме, мультиорганную дисфункцию и септический шок.

Критерии диагностики сепсиса

Характеристика сепсиса: Сепсис. При тех же симптомах, что и в случае системного воспалительного синдрома, в одной из стерильных в норме тканей (в крови, цереброспинальной жидкости, в моче…) обнаруживают один из патогенов. Тяжелый сепсис. Характеризуется так же, как обычный сепсис, но с гипотензией гипоперфузией или дисфункцией отдельных органов.

Септический шок Септический шок - сепсис, сопровождающийся артериальной гипотензией, (которая не устраняется даже интенсивной адекватной инфузионной терапией), и перфузионными расстройствами, которые не ограничиваются лактатным ацидозом, олигурией или острыми расстройствами функций центральной нервной системы. У пациентов, получающих инотропные или вазопрессорные препараты, несмотря на наличие перфузионных расстройств, гипотензия может отсутствовать. Гипотензия (артериальная гипотензия)- состояние кровообращения, при котором систолическое артериальное давление составляет 90 мм рт. ст. или оно снижается на 40 мм рт. ст. от базового уровня (при отсутствии других очевидных причин для гипотензии).

Лабораторные данные при сепсисе : В крови: - анемия: Hb на 60% ниже нормы - вероятность выздоровления - 10% - лейкоцитоз со сдвигом влево (или лейкопения) - отмечается быстро нарастающая гипопротеинемия: содержание белка менее 50 г/л и ниже, -содержание альбуминов снижается до 30% -уровень глобулинов увеличивается. снижение тромбоцитов - увеличение СОЭ - снижение фосфатов - увеличение лактата - активация протеолиза - увеличение провоспалительных цитокинов - увеличение CРБ увеличение прокальцитонина В моче: протеинурия, цилиндрурия, гематурия, лейкоциты. При исследовании мочи выявляют низкую относительную плотность, белок, цилиндры, лейкоциты, бактерии.

Диагностические критерии сепсиса делят на:

2. Показатели воспаления Степень интоксикации отражает ЛЕЙКОЦИТАРНЫЙ ИНДЕКС ИНТОКСИКАЦИИ

2. Показатели воспаления 1. Лейкоцитоз (>12 *10⁹ /л) или лейкопения (<4*10⁹ /л) 2. Сдвиг в сторону незрелых форм (>10%) при нормальном содержании лейкоцитов 3.СРБ превышает нормальное значение > , чем на 2 значения стандартного отклонения от нормы 4. Прокальцитонин (ПКТ) в крови превышает нормальное значение > , чем на 2 значения стандартного отклонения от нормы

3. Гемодинамические параметры 1. Артериальная гипотензия: САД < 90 мм рт.ст., (среднее < 70 мм рт.ст) или снижение САД более, чем на 40 мм рт. ст. (у взрослых), или снижение САД менее, чем на 2 стандартных отклонения ниже нормального значения для данного возраста 2. Сатурация кислорода в крови (SvO₂) 70% 3. Сердечный индекс > 3,5 л /мин /м²

4. Показатели нарушений функции других органов Артериальная гипоксемия - PaO₂/FiO₂ < 300 Острая олигурия < 0,5 мл /кг /ч (в течение минимум 2 ч., несмотря на надлежащий режим регидратации) Повышение креатинина более, чем на 44 мкмоль / л Нарушение коагуляции: АЧТВ > 60 с , или МНО > 1,5 Тромбоцитопения < 100 x 10⁹ /л Гипербилирубинемия > 70 ммоль /л Парез кишечника (отсутствие перистальтики) Показатели тканевой гипоперфузии Гиперлактатемия

б). Лактат, как маркер сепсиса Является ли шоком гипотензия при сепсисе без гиперлактатемии?

лактат Это анион молочной кислоты, продукт внутриклеточного метаболизма глюкозы, образуется при анаэробном энергетическом метаболизме из пирувата, катализируется ЛДГ. При аэробном гликолизе глюкоза превращается до СО2 и Н2О синтезом АТФ (38 молекул). При анаэробном гликолизе образуется лактат и 2 молекулы АТФ. Увеличение уровня лактата – ранний чувствительный индикатор нарушения соответствия потребности тканей в кислороде и доставке кислорода. Увеличение лактата связано с риском осложнений и смертностью.

6. Показатели нарушения свертывающей системы крови Нарушением коагуляции: Развивающийся ДВС синдром приводит к блокаде микроциркуляции в сосудах органа, тромботическим процессам и геморрагиям.

Критерии органной дисфункции при сепсисе или шкала оценки органной недостаточности, связанной с сепсисом – SOFA(Sepsis –related Organ Failure Assesement).

Проблемы диагностики сепсиса: если быстро, то неспецифично; если специфично, то долго Повышение уровней традиционно применяемых для диагностики воспалений маркеров (СРБ, IL-6, TNFα и др. ) происходит не только при инфекциях, но и при некрозах тканей (ожоги, травмы, панкреатит) и при некоторых злокачественных опухолях.

Основные лабораторные критерии локальной и генерализованной форм инфекции

Прокальцитонин –лучший показатель для ранней диагностики сепсиса ПКТ был открыт в 1984 г как предшественник (прогормон) кальцитонина. Кальцитонин – пептидный гормон, синтезируемый, в основном, парафолликуллярными С-клетками щитовидной железы. В норме ПКТ – это промежуточный продукт образования кальцитонина (препрокальцитонин -> прокальцитонин -> кальцитонин). ПКТ при воспалительных процессах – маркер сепсиса. При воспалительном процессе, вызванном бактериальными и грибковыми инфекциями, а также простейшими, уровень ПКТ в крови возрастает в течение 6-12 часов. При этом концентрация кальцитонина не повышается.

Уровень ПКТ не всегда связан с системной бактериальной инфекцией, он может повышаться:

Выполнение прокальцитонинового теста 1. Проведение анализа Пакет индивидуального теста вскрыть непосредственно перед проведением теста. Внести пипеткой (прилагается к набору) 6 капель образца в круглую лунку BRAHMS PCT-Q. Пипетку следует заполнять до мерной линии, без пузырьков. Тест инкубируется 30 минут при комнатной температуре. Время начала теста отметить на справочной карте.  2. Визуализация и оценка результата. Спустя 30 минут (максимум 45 минут) определяется уровень концентрации PCT. Правильная работа тест-системы обязательно проверяется наличием окрашенной полосы в зоне «контрольной полосы»    

Диагностические уровни прокальцитонина (нг/мл) Норма. Нижняя граница измерения ~ 0,05 В норме уровни ПКТ достоверно не определяются Серая зона Синдром системной воспалительной реакции без инфекции < 1,0 Локальные бакинфекции без системных проявлений 0,3 -1,5 Тяжелые вирусные инфекции, воспаление неинфекционного происхождения 0,5 – 2,0 Диагноз сепсиса с уверенностью нельзя поставить, нужно повторить измерения через 6-24 ч. Большая вероятность прогрессирующего сепсиса 2,0 – 10,0. При продолжительном повышенном значении (более 4 дней) провести оценку проводимой терапии сепсиса. Неблагоприятное течение. Тяжелый сепсис, септический шок > 10,0. Большой риск летального исхода, часто связан с органной недостаточностью

Возможности ПКТ

Существенно, что при инфекции: а) ПКТ вырабатывается вне щитовидной железы, в различных органах (в печени, почках, в адипоцитах и в мышцах) и разными типами клеток, в частности, паренхимальными б) синтез ПКТ индуцируется эндотоксинами в) выбросу ПКТ предшествует повышение уровней провоспалительных цитокинов: ИЛ-6 и ФНО

Несмотря на неоднозначность литературных данных по ПКТ, большинство авторов считают: 1. Удобный диагностический маркер бактериальной инфекции. Высокий цифры говорят о бактериальной инфекции. 2. Диагностика тяжести состояния 3. Алгоритмы управления антибиотикотерапией 4. Лучше использовать количественные методы, т.к. при управлении а/б терапией уровень принятия решения о назначении а/б находится при ПКТ между 0,25 и 0,5. 5. Оценивать в динамике состояние

Липополисахаридсвязывающий белок- белок острой фазы, маркер инфекционного процесса ЛСБ -белок острой фазы воспаления, ответственный за связывание эндотоксинов с mCD14 моноцитов/макрофагов, синтезируется в печени. При инфекции синтез ЛСБ повышается. Кроме эндотоксина грамотрицательных бактерий, ЛСБ специфически связывается с компонентами клеточной стенки: а) грамположительных бактерий б) микобактерий - липопротеины, липоманнаны; в) микоплазм - липопептиды, г) спирохет - гликолипиды и липопротеины, д) грибков.

Пресепсин –новый биомаркер сепсиса Пресепсин (ПСП) – это белок (мол. масса 13 КДа) являющийся N-концевым фрагментом рецептора макрофагов CD14. CD14 – это белок, существующий в двух формах: 1) В связанной с мембраной (mCD14) и присутствующей на поверхности макрофагов, моноцитов и гранулоцитов 2) В растворимой (sCD14, s – soluble, растворимый), циркулирующей в кровотоке. mCD14 – рецептор, ответственный за трансдукцию эндотоксинового сигнала внутрь клеток. Выход mCD14 в кровоток и образование sCD14 связаны с инфекцией и с некоторыми другими патологическими состояниями. При активации бактериального фагоцитоза sCD14 и mCD14 расщепляются лизосомальными протеиназами с образованием фрагмента, исходно названного sCD14-subtype (sCD14-ST), а потом переименованного в пресепсин. Один из механизмов образования ПСП связан с бактериальным фагоцитозом и расщеплением m и s CD14 лизосомальными ферментами

Механизм образования ПСП . mCD14 – СD14, связанный с мембраной, sCD14 – растворимый CD14, sCD14-ST – пресепсин, ЛПС –липополисахарид, ЛСБ – липополисахарид связывающий белок, TLR4 – толл-подобный рецептор 4; MD2 – белок, связанный с TLR4.

Пресепсин Пресепсин –маркер септических состояний, позволяет проводить: а) раннюю и точную дифференциальную диагностику SIRS и сепсиса, б) оценку тяжести сепсиса, в) оперативный мониторинг эффективности его терапии, г) прогнозирование его исхода, особенно эффективное при параллельной оценке тяжести пациента согласно шкалам APACHEII, SOFA и MEDS. Согласно результатам клинических исследований уровни ПСП имеют связь со степенью тяжести сепсиса и 30-дневной смертностью. Уровни пресепсина повышены в зависимости тяжести сепсиса и мониторинга его течения Пресепсин используют для оценки риска смертности

Диагностические уровни пресепсина, пг/мл

Показано, что ПСП 1.) продуцируется при сепсисе, связанном с грамотрицательными и грамположительными бактериями 2.) с грибками и при вирусных инфекциях ПСП не продуцируется.

ПСП - маркер риска неблагоприятного исхода

Микробиологическая диагностика сепсиса Кишечная палочка, вызывает нагноительные процессы, образуя нагноительных карманы в подкожной клетчатке. При наличии этого сепсиса может наблюдаться эндотоксический шок, ДВС-синдром и гипотония. Симптоматика разнообразна, из-за межштамового и межвидового генетического обмена возбудителя. Распространены штаммы, тропные к ЦНС и мочевыводящим путям, вызывая гемолитико- уремический синдром и диарею.  

Микробиологическая диагностика сепсиса

Для проведения адекватной микробиологической диагностики сепсиса следует строго соблюдать следующие правила: 1. Кровь для исследования необходимо забирать до назначения антибиотиков. В условиях невозможности отмены антибиотиков при сепсисе, взятие крови следует выполнять непосредственно перед очередным введением препарата. 2. Необходимым минимумом забора является две пробы, взятые из вен разных верхних конечностей с интервалом 30 минут. Оптимальным является забор трех проб крови, что существенно повышает возможность выявления возбудителя. Большее количество проб не имеет преимуществ перед трехкратным забором в плане частоты выявления бактериемии. Забор крови на высоте лихорадки не повышает чувствительности метода 3. Кровь для исследования необходимо забирать только из периферической вены. Не показано преимуществ забора крови из артерии 4. Оптимальным является использование стандартных коммерческих флаконов с готовыми питательными средами, а не флаконы с питательными средами, закрытые ватно-марлевыми флаконами, приготовленными в лаборатории. 5. Забор крови из периферической вены следует проводить с тщательным соблюдением асептики. Кожу в месте венепункции обрабатывают раствором йода или повидон-йода движениями от центра к периферии в течение минимум 1 минуты. Непосредственно перед забором кожу обрабатывают 70% спиртом. При проведении венепункции используют стерильные перчатки. Крышку флакона со средой обрабатывают спиртом. Для каждой пробы забирают 10 мл крови.

Бактериологические исследования при сепсисе 2. Бактериологический метод: Посев крови во флаконы с питательной средой (в соотношении 1:10). Питательные среды для первичного посева: «двойная среда», среда для контроля стерильности, среда Тароцци, среда Сабуро (для выявления грибковых септических состояний). Культивирование при 37 ⁰С. При появлении видимого роста окрашивают по Грамму. И далее делают посевы на среды для определения чувствительности и проводят идентификацию выделенных бактерий. При подозрении на анаэробную флору делают параллельные посевы для культивирования в аэробных и анаэробных условиях. При отсутствии видимого роста делают посевы на чашки Петри с 5% кровяным агаром и мазки на стеклах, окрашенные по Грамму. При отсутствии роста дают отрицательный ответ. Флаконы с засеянной средой не выбрасывают, оставляют для выявления замедленного роста персистирующих бактерий, бактерий в L-форме и т.д. Оценка результатов- рост на всех средах - явная бактериемия. Выделение непатогенных видов как эпидермальный стафилококк или кишечная палочка следует считать проявлением бактериемии. При отсутствии роста в аэробных условиях и наличии грамотрицательных палочек в осадке при посеве на среду Тароцци, повторяют посев в анаэробных условиях, для того чтобы выделить анаэробы, особенно не спорообразующие виды бактероидов, клостридий и др.

Проточная цитофлюориметрия и сепсис Мониторинг септического состояния: 1. Измерение экспрессии HLA-DR- антигенов на поверхности моноцитов в цельной периферической крови. Для локализации моноцитов используют CD14 –рецептор эндотоксина (липополисахарид LPS), один из маркеров для моноцитов. Значительное снижение экспрессии HLA-DR на моноцитах может служить тестом для идентификации временной иммунодепрессии. Моноциты у здоровых индивидуумов экспрессируют на своей поверхности молекулы HLA-DR в высокой плотности и легко определяются методом проточной цитометрии. Но моноциты с уменьшенной или отсутствующей экспрессией молекул HLA-DR не могут выполнять свою антигенпредставляющую функцию и не обладают способностью продуцировать воспалительные медиаторы в ответ на соответствующие стимулы. Считается что снижение экспрессии связано с усиленной продукцией IL-10. 2. Измерение экспрессии CD64 – поверхностного маркера нейтрофилов. Он быстро повышает свою экспрессию в течение инфекции и сепсиса, хотя у здоровых людей его плотность на поверхности нейтрофилов незначительна (< 2000 молекул на клетку). Увеличение его экспрессии связано с действием медиаторов воспаления, таких как IFN-γ(3-4 ч.), G-CSF(4-6 ч) и IL-12. Повышение экспрессии CD64 зависит от интенсивности стимула цитокинов и устойчиво в течение более чем 30ч. Она не повышается при терапии любыми препаратами (отличными от цитокинов), при беременности, при ограниченном повреждении ткани (ишемия миокарда, несложные хирургические вмешательства и травмы), при аутоиммунных заболеваниях (СКВ, РА).

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!