🗊Презентация Масс-спектрометрия

Масс-спектрометрия Гиндуллина Т.М.

Масс-спектрометрия (МС) Метод МС - метод исследования и анализа веществ основан на ионизации атомов и молекул вещества и последующем разделении образующихся ионов в соответствии с их массовым числом m/z -отношением массы иона к его заряду - в электрическом или магнитном поле

Преимущество метода в том, что для анализа достаточно очень малое количество вещества, основной недостаток – метод является разрушающим, т. е. исследуется не само вещество, а продукты его превращения Строго говоря, метод МС не относится к спектроскопическим, поскольку в его основе нет взаимодействия вещества с электромагнитным излучением, но внешний вид графического распределения ионов по массовым числам - зависимость интенсивности ионного тока от отношения массы к заряду - напоминает спектр и получил название масс-спектр, а сам метод - масс-спектрометрия

Масс-спектрометр — это вакуумный прибор, использующий физические законы движения заряженных частиц в магнитных и электрических полях, и необходимый для получения масс-спектра

Блок-схема масс-спектрометра 1 – система ввода образца 2 – источник ионизации с ускорителем ионов 3 – масс-анализатор (устройство для разделения ионов) 4 – детектор 5 – измерительное или регистрирующее устройство Чтобы исключить соударение ионов с другими атомами или молекулами, анализ происходит в вакууме (в ионизаторе давление 10–3 – 10–4 Па, в масс-анализаторе - 10–3 – 10–8 Па)

Принцип метода Пробу вводят в источник ионизации, где молекулы ионизируются Образующиеся положительные ионы выводятся из зоны ионизации, ускоряются электрическим полем и одновременно фокусируются в пучок. Нейтральные молекулы удаляются вакуум-насосом Поток ускоренных ионов попадает в масс-анализатор, где ионы разделяется по массе Разделенные пучки ионов попадают в детектор, где ионный ток преобразуется в электрический сигнал, который усиливается и регистрируется

Система ввода пробы Количество вводимой пробы не превышает нескольких микромолей, чтобы не нарушить вакуум внутри прибора 1.Непрямой способ - пробу вводят в ионизатор в газообразном состоянии Жидкие и твердые пробы испаряют(~500 °С) в вакуумной камере, и пары через специальное отверстие поступают в ионизатор 2.Прямой способ - используется для труднолетучих проб Образец непосредственно вводят в ионизатор с помощью штанги через систему шлюзовых камер В этом случае потери вещества значительно меньше, масса пробы - несколько нг

Схема прямого ввода образца в масс-спектрометр:

3. Анализируемое вещество поступает в масс-спектрометр в ходе хроматографического разделения В настоящее время сочетание газовой и жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ-МС, ЖХ-МС) в режиме on-line используют для рутинного анализа во многих областях аналитической химии

Способы ионизации Способы ионизации атомов и молекул зависят от конкретной цели анализа

В неорганической химии для анализа элементного состава применяются жёсткие методы ионизации, так как энергии связи атомов в твёрдом теле гораздо больше и значительно более жёсткие методы необходимо использовать для того, чтобы разорвать эти связи и получить ионы ионизация в индуктивно связанной плазме (ICP) термоионизация или поверхностная ионизация ионизация в тлеющем разряде и искровая ионизация ионизация в процессе лазерной абляции Исторически первые методы ионизации были разработаны для газовой фазы К сожалению, очень многие органические вещества невозможно испарить, то есть перевести в газовую фазу, без разложения, а это значит, что их нельзя ионизовать электронным ударом

Но среди таких веществ почти всё, что составляет живую ткань (белки, ДНК и т. д.), физиологически активные вещества, полимеры, то есть всё то, что сегодня представляет особый интерес Масс-спектрометрия не стояла на месте и последние годы были разработаны специальные методы ионизации таких органических соединений Сегодня используются, в основном, два из них 1. ионизация при атмосферном давлении и её подвиды – электроспрей (ESI) химическая ионизация при атмосферном давлении(APCI) фотоионизация при атмосферном давлении(APPI) 2. ионизация лазерной десорбцией (MALDI) Форма получаемого масс-спектра сильно зависит от способа ионизации Наиболее часто используют ионизацию электронным ударом

Электронный удар – метод широко применяется для ионизации органических соединений Пары образца бомбардируют ускоренными электронами При столкновении электронов с органической молекулой вначале образуется катион-радикал М + e → М + ∙ + 2e затем происходит его распад (фрагментация), и образуются дочерние ионы с меньшими массами

Эффективность ионизации зависит от энергии ионизирующих электронов, максимум эффективности достигается при энергии примерно в 70 эВ

Ионизация электронным ударом – зависимость интенсивности пика молекулярного иона от величины энергии ионизации:

Масс-спектрометр регистрирует лишь положительные ионы, отрицательные ионы, нейтральные радикалы и молекулы не регистрируются Достоинства метода Метод ионизации электронным ударом дает богатые фрагментами масс-спектры, которые однозначно характеризуют структуру молекулы, что удобно для идентификации веществ Масс-спектрометрия электронного удара - высокочувствительный метод анализа, позволяет анализировать пикомольные количества вещества Существуют "библиотеки" масс-спектров, содержащие спектры более 70000 органических соединений, по которым можно проводить их идентификацию с применением ЭВМ

Недостатки метода: Молекулярные ионы образуются лишь у 20% органических соединений метод применим только для определения легколетучих термически стабильных соединений; ионы с большими значениями m/z, дающие информацию о молекулярной массе и наличии функциональных групп обеспечивают небольшой вклад в значения полного ионного тока отрицательно заряженные ионы, имеющие большое значение в структурном анализе, образуются в очень небольшом количестве и ограниченным числом органических соединений

Масс-спектр метанола (CH3OH)

Химическая ионизация– более мягкий способ ионизации Пары пробы смешивают с большим избытком газа-реагента (метан, изобутан, аммиак или NO), газ-реагент ионизируют действием электронного удара

Определяемые молекулы ХН ионизируются непосредственно ионами реагентного газа за счет ряда реакций, например: CH5+ + ХН → ХH2+ + CH4 Далее протонированная молекула образца выталкивается электрическим полем в сторону масс-анализатора Достоинства: 1. Мягкий метод ионизации, молекуле образца передается около 5 эВ избыточной энергии, что препятствует процессам фрагментации и позволяет подвергать анализу нестойкие молекулы 2. Интенсивный пик молекулярного иона, что позволяет определить молекулярную массу Недостатки: 1. Отсутствие фрагментации, очень простые масс-спектры, что не позволяет судить о структуре вещества и сравнить спектр с базами масс-спектральных данных 2. Возможно провести анализ только тех соединений, которые можно перенести в газовую фазу (испарить)

Электроспрей (электрораспыление) Вещество на ионизацию поступает в полярном растворителе (вода, метанол, ацетонитрил и др.), содержащем ионы водорода и катионы щелочных металлов (натрий, калий), через металлический капилляр (распылитель), к которому приложено высокое напряжение Продвигаясь в электрическом поле капля раствора испаряется под действием нагретого потока инертного газа (азот) и распадается на ряд мелких положительно заряженных капель, которые попадают в масс-анализатор

Достоинства: Метод позволяет работать с веществами, которые нельзя перевести в газовую фазу Удобен для сочетания масс-спектрометра с жидкостным хроматографом Возможность анализа крупных (до нескольих миллионов дальтон) молекул Мягкое (низкоэнергетическое) ионизационное воздействие Недостатки: Вещество должно быть растворимо в полярных растворителях Масс-спектр малоинформативен, как правило, присутствуют лишь пики комплексов молекулярного иона с катионом (H+, Na+, K+), многозарядных ионов таких комплексов

Лазерная десорбция Матричная лазерная десорбция – метод, при котором исследуемое вещество помещают в «матрицу» - перемешивают с веществом, имеющим меньший молекулярный вес и обладающим высокой способностью поглощать лазерное излучение (например, коричная кислота, 3-гидроксипиколиновая кислота, 6,7-гидроксикумарин и т.д.).

Достоинства: 1. Возможность анализа крупных молекул (массой до 100 000 дальтон и выше) 2. Мягкая ионизация образца 3. Возможность анализа загрязненных примесями образцов Недостатки: 1. Малоинформативный масс-спектр – присутствуют лишь пики молекулярного иона и его «мультимеров» - частиц, состоящих из нескольких молекул образца с зарядом +1 2. Долгая пробоподготовка и необходимость подбора условий под образец - подбирать вещество для матрицы

Полевая ионизация В этом методе ионизация происходит под действием электрического поля высокой напряженности (до 108 В/см) Ионизация происходит на эмиттере – вольфрамовой проволоке, покрытой пиролитическим углеродом. Частицы углерода образуют на поверхности проволоки микроскопические острия, они увеличивают локальную напряженность поля и способствуют ионизации метод относится к мягким способам ионизации Количество образующихся фрагментов невелико, спектр достаточно простой и содержит молекулярный пик Рассмотренные способы ионизации требуют предварительного испарения пробы (~500 °С) и применимы для изучения молекул с молекулярными массами менее 1000

Химическая ионизация при атмосферном давлении – метод, похожий на электрораспыление. Используется для стыковки жидкостного хроматографа с масс-анализатором. Поток из колонки жидкостного хроматографа направляется в распылитель, где он превращается в мелкодисперсный аэрозоль и смешивается с большим количеством нагретого газа (азота или воздуха), далее капли аэрозоля перемещаются в область испарения, где в газовую фазу переходит большая часть молекул растворителя. Далее на пути уже газообразного образца следует область ионизации:

Ионизация происходит при атмосферном давлении либо коронным разрядом, либо бета-излучателями. Далее электрическое поле и поток увлекает ионизированные частицы в последовательные сепараторы, где происходит быстрая откачка легких молекул (газ, растворитель), а ионизированные частицы образца попадают в анализатор с глубоким вакуумом Достоинства: 1. Работа ионного источника при атмосферном давлении 2. Необязательно использовать только полярные растворители для образца (как в случае электрораспыления) 3. Возможность работы с образцами, которые сложно перевести в газовую фазу обычными методами Недостатки: 1. Возможен анализ образцов с массой примерно до 1500 дальтон, что относительно немного 2. Полученные масс-спектры малоинформативны и не позволяют использовать их для структурных исследований (мало линий)

Десорбционные методы используют при исследовании биоорганических веществ с молярными массами порядка10 000 Ионизации подвергается твердая или жидкая проба без предварительного испарения Масс-спектры крайне просты и в предельном случае состоят только из молекулярного иона В настоящее время для ионизации все шире используют лазеры, например, УФ-лазер с длиной волны 337 нм Полевая десорбция Как и в методе полевой ионизации пробу ионизируют на эмиттере под действием высокого напряжения. Для облегчения ионизации эмиттер нагревают электрическим током

При бомбардировке быстрыми атомами пробу помещают в ионизатор непосредственно или растворяют в подходящей нелетучей матрице, обычно в глицерине Затем пробу облучают потоком нейтральных высокоэнергетических (около 8кэВ) атомов, например, Аг или Хе Бомбардировка пробы приводит к образованию + и – ионов, которые в результате десорбции отрываются от поверхности Выход ионов анализируемого образца тем больше, чем больше масса ускоренных атомов

Масс-анализаторы Масс –анализатор – устройство для разделения ионов в соответствии с отношением m/z Существует более 10 типов динамических масс-анализаторов Основные типы масс-анализаторов магнитные квадрупольные времяпролетные «ионная ловушка»

В магнитном масс-анализаторе для разделения ионов используют однородное магнитное поле Согласно законам физики, траектория заряженных частиц в магнитном поле искривляется, причем радиус кривизны зависит от их массы и заряда z – заряд иона, m – масса иона, U0 – ускоряющий потенцал, Н - напряженность магнитного поля

Именно этот факт и используется для анализа масс ионов Достоинство магнитных масс-спектрометров высокое разрешение, чувствительность, большой диапазон детектируемых масс основной недостаток – большой размер приборов и высокая стоимость

В квадрупольном масс-анализаторе ионный пучок направляют в пространство между четырьмя параллельными электродами Это стержни (0,6 х15 см) из нержавеющей стали, одна пара по диагонали противоположных стержней заряжена положительно, другая - отрицательно Одновременно на электроды наложено высокочастотное переменное напряжение

Под действием электрических полей заряженные частицы колеблются и при фиксированном значении частоты и амплитуды переменного поля только ионы с определенным значением m/z проходят через квадруполь Частицы с другими значениями масс сталкиваются со стержнями и выбывают из потока При этом происходит своеобразная фильтрация ионов Чтобы зафиксировать ионы с другим массовым числом, меняют либо частоту, либо амплитуду переменного поля. Так формируется масс-спектр Недостаток приборов этого типа: верхний предел пропускания находится между m/z 1000 и 2000 Достоинства: высокая чувствительность, небольшие размеры, невысокая цена, удобство в эксплуатации; время регистрации спектра до 0,1 с, что очень важно в сочетании прибора с хроматографией

Квадрупольный масс-спектрометр вторичных ионов (PHI ADEPT - 1010 D - SIMS).

Разновидность квадрупольного масс-анализатора – трехмерная ионная ловушка Два концевых (полюсных) гиперболических по форме электрода заземлены, между ними располагается электрод кольцевой формы, на который подается радиочастотное напряжение мегагерцового диапазона

Эта система электродов создает поле, позволяющее удерживать ионы достаточно долгое время Для ионизации образца используется электронная или химическая ионизация в импульсном режиме (0,1 – 10 мс) Импульсное изменение амплитуды радиочастотного напряжения на центральном электроде заставляет ионы с определенным m/z переходить на нестабильные траектории и покидать ловушку (образованную полем центрального электрода), попадая в систему регистрации - на электронный умножитель Селективная регистрация ионов позволяет существенно повысить чувствительность измерений

м Действие времяпролетных масс-анализаторов основано на зависимости скорости движения ионов от их массы. Их особенность: ионы движутся в бесполевом пространстве После ускорителя все ионы обладают одинаковой кинетической энергией E = mv2/2 , следовательно, чем больше их масса, тем меньше скорость, тем больше время пролета иона через анализатор Время пролета составляет несколько микросекунд Метод применим для определения массы больших молекул (десятки и сотни тысяч атомных единиц)

Достоинство приборов: простота, относительно небольшая стоимость, надежность в эксплуатации и диапазон измеряемых масс (10 4 - 105 а.е.) Популярны при исследовании соединений, непереводимых в газовую фазу

Детекторы ионов Сначала в качестве детектора использовалась фотопластинка В настоящее время применяют динодные вторично-электронные умножители, в которых ион, попадая на первый динод, выбивает из него пучок электронов, которые в свою очередь, попадая на следующий динод, выбивают из него ещё большее количество электронов и т. д. микроканальные умножители, системы типа диодных матриц и коллекторы, собирающие все ионы, попавшие в данную точку пространства (коллекторы Фарадея)

Представление масс-спектров На графике по оси абсцисс откладывается отношение массы иона к его заряду, m/z, а по оси ординат - интенсивность, характеризующая относительное количество ионов данного вида Интенсивность выражается в процентах по отношению к полному ионному току (суммарной интенсивности всех ионов в масс-спектре) или по отношению к максимальной интенсивности ионного тока в масс-спектре

Анализ по масс-спектрам 1. Определение молярной массы Источник информации – положение молекулярного пика М+ или его производных (М+1)+ (М–1)+ 2. Определение брутто-формулы – используют соотношение интенсивностей пиков изотопов элементов Например, число атомов углерода в молекуле определяют по интенсивности пика иона с массой (М+1)+ - он имеет такую же структуру, но содержит атомы 13С Содержание этого изотопа в природе - 1,1%, поэтому интенсивность пика иона с изотопом 13С равна 1,1n%, где n – число атомов углерода

3. Определение структуры органических соединений основано на изучении пиков осколочных ионов При столкновении электронов с органической молекулой вначале образуется катион-радикал ABCD + e → ABCD + ∙ + 2e С увеличением энергии электронов происходит его распад, фрагментация Одновременно происходят внутримолекулярные перегруппировки

Ионизация длится около 10-16с, время прохождения ионом пути до детектора не менее 10-5с . За это время из исходного иона образуется большое число осколков Молекулярный ион появляется, если энергия электронов соответствует энергии ионизации молекулы (около 7-13 эВ), обычно энергия электронов составляет около 70 эВ, поэтому масс-спектры достаточно сложные Вероятность образования молекулярного иона и его устойчивость зависит от класса соединений

Качественный анализ Наиболее представительные ионы и соответствующие им структуры помещены в таблицы, их используют при интерпретации масс-спектров Кроме того сравнивают масс-спектры изучаемого соединения с каталогом спектров (до 150 000 спектров различных соединений) При идентификации исходят из того, что характер фрагментации неизвестного вещества и соединения с предполагаемой структурой одинаков, а спектры получены в близких экспериментальных условиях, что не всегда выполняется ( например, спектры изомеров не различаются) В любом случае вероятность совпадения масс-спектров одного и того же вещества выше, чем масс-спектров разных веществ

Количественный анализ Возможны вещественный и элементный анализ Количественный анализ смесей органических соединений часто ограничен сложностью масс-спектра Поэтому метод МС сочетают с различными видами хроматографии и капиллярного зонного электрофореза 1) Для вещественного анализа используют ГХ В ходе хроматографирования регистрируют во времени интенсивность какого-либо пика с определенным массовым числом В результате получается зависимость сигнала детектора от времени , как в хроматографии

Для построения масс-хроматограммы берут интенсивности пиков нескольких ионов из каждого записанного масс-спектра и строят график зависимости этих интенсивностей от номера масс-спектра, соответствующего времени удерживания

2) Сочетание метода разделения и МС-определения возможно в виде тандемной МС Один масс-спектрометр служит для выделения молекулярных пиков отдельных веществ из масс-спектра их смеси Второй – для фрагментации выделенных веществ и дальнейшей идентификации 3) непосредственный анализ по масс-спектру Для этого измеряют интенсивность пика определяемого компонента и внутреннего стандарта – обычно это меченая изотопом разновидность определяемого вещества или его гомолог

Возможности газовых хромато-масс-спектрометров

Времяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения Bruker micrOTOFQ с жидкостным хроматографом Agilent 1100

Возможности жидкостных хромато-масс-спектрометров

Элементный анализ Для ионизации образцов используют электрическую искру, индуктивно связанную плазму, тлеющий разряд Искровую ионизацию применяют для твердых проб, используют масс-анализатор с двойной фокусировкой Абсолютный предел обнаружения 10-12 г, одновременно можно определять до 60-70 элементов При использовании ИСП или тлеющего разряда применяют квадрупольные масс-анализаторы МС с ИСП – очень важный метод анализа растворов, позволяющий определять любые элементы (с m/z начиная от 3) и пределом обнаружения 0,1-10 частей на миллион (10–5 –10–3%)

Аналитические возможности метода Позволяет определять массы ядер и атомов и оценивать распространенность изотопов в природе По соотношению масс изотопов материнского и дочернего излучений определяют возраст горных пород, археологических и др. объектов МС применяют для элементного анализа твердых неорганических веществ и материалов для идентификации и установления структуры органических соединений, включая определение молярной массы для исследования состава и структуры поверхностей твердых тел (локальный, послойный и фазовый анализ)

Для МС характерны Использование небольших навесок ( 1 мг и меньше) Высокая чувствительность все элементы периодической системы определяют с чувствительностью 10-12 г при использовании лазерных источников ионизации достигается чувствительность 10-19 г Универсальность – возможность анализа широкого круга объектов от элементов до сложных белковых молекул Высокая специфичность и селективность Недостаток масс-спектрометрии: это деструктивный метод анализа, и используемый образец нельзя восстановить для дальнейшего анализа или синтеза

Области применения МС Ядерная энергетика Археология Нефтехимия Геохимия (изотопная геохронология) Агрохимия Химическая промышленность Анализ полупроводниковых материалов, особо чистых металлов, тонких пленок и порошков (например, оксидов U и РЗЭ) Фармацевтика - для контроля качества производимых лекарств и выявления фальсификатов Медицинская диагностика Биохимия – идентификация белков, исследование метаболизма лекарственных средств

Аналитический контроль в ядерной энергетике Основные применения изотопной и элементной масс-спектрометрии в различных аспектах ядерной энергетики : 1. Разработка и производство ядерного топлива – определение примесей посторонних элементов и изотопного состава расщепляющихся материалов, в частности для для анализа изотопных отношений гексафторида урана 2. Переработка вторичного ядерного топлива для повторного использования - никакими другими методвами, кроме МС невозможно установить степень регенерации топлива Разбавление ураном с природной распространенностью или обедненным ураном требует контроля изотопного состава, как и в случае производства нового топлива. Однако, требуется проводить дополнительный тщательный контроль на предельно низком уровне содержания изотопов 232U, 233U, 234U, 236U и ряда техногенных элементов, например, технеция (Tc), плутония (Pu), к появлению которых приводит нахождение материалов в реакторе

3. Хранение отходов ядерных материалов - во время хранения, помимо дозиметрии, должен проводиться контроль и по изотопному / элементному составу, для чего МС незаменима 4. Установление источников происхождения расщепляющихся материалов Если мажорные компоненты материалов (например, уран или плутоний), как правило, не несут информации об источнике происхождения, то минорные компоненты на уровне микропримесей являются отпечатками технологических процессов или месторождений Информативными характеристиками является как микрокомпонентный примесный состав, так и соотношение изотопов в этих компонентах

5. Контроль окружающей среды Влияние на окружающую среду - это попадание радионуклидов и токсичных элементов в воздух, почву, воду, растения Методы масс-спектрометрии позволяют определять содержание этих элементов в объектах окружающей среды на предельно низком уровне, определение изотопных отношений элементов в объектах окружающей среды позволяет получить информацию об источнике загрязнения и времени их попадания Только один показательный пример. Производимые с 1986 г. измерения 90Sr в годовых кольцах деревьев Англии позволяют проводить оценку диссипации окружающей средой выброса радионуклидов в момент Чернобыльской аварии

6. Контроль воздействия расщепляющихся материалов на живые организмы Выявление присутствия расщепляющихся материалов в живых организмах требует очень высокой чувствительности, кроме того анализ надо проводить в присутствии сложнейших биологических матриц. Анализ элементного и изотопного состава позволяет определить источник попадания радионуклидов или техногенных элементов в организм человека, животных или продукты питания, выяснить механизм воздействия на живые организмы

МС изучает окаменевшие останки

МС поможет изучить наноалмазы

МС применялась для анализа марсианского грунта ещё в семидесятых годах прошлого века, во времена программы "Викинг"

Метод масс-спектрометрии позволяет выявить контрафактные ценные бумаги

МС – экспрессный метод анализа респираторных газов Диагностика сахарного диабета на основе МС- регистрации 13 СО2 в выдыхаемом воздухе после приема тестовой мочевины, содержащей повышенное количество стабильного 13 С изотопа по сравнению с его природной распространенностью

Гемаскрин ДНК новорожденных - диагностика наследственных особенностей (генетического полиморфизма)

Хромато–МС - метод мониторинга изменений в определенных белках (гистонах), которые могут служить биомаркером у пациентов с хронической лейкемией