🗊 СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ СПбГУ 2013г.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ СПбГУ 2013г.

Сложности диагностики получение ложноотрицательного результата : неправильное взятие материала, несвоевременная доставки его в лабораторию, несовершенная методика бактериологического исследования угнетение жизнеспособности или гибели возбудителя под действием проводимого лечения (если материал берется не в первые дни заболевания, а уже на фоне этиотропной терапии)

Сложности диагностики получение ложноположительного результата : контаминация материала бактериооносительство выделение условно-патогенных микроорганизмов

Сложности диагностики Выделенный микроорганизм является возбудителем, если: подтверждена триада Коха многократность обнаружения данных видов, массивность роста бактерий в высевах на плотные питательные среды, антигенная и фаговаровая однородность выделяемых субкультур диагностического нарастания титров гомологичных антител при серологических исследованиях.

Микробиологические методы диагностики делятся на: методы прямого обнаружения возбудителя в организме больного — бактериоскопическое и бактериологическое исследования; методы косвенного доказательства наличия возбудителя в организме больного —иммунологические исследования, направленные на обнаружение специфических антигенов в инфицированном материале или антител в сыворотке крови и различных секретах организма больного.

Бактериоскопическое исследование

Бактериологический метод

Строение антител (Ig)

Строение антител (Ig)

Строение и классы иммуноглобулинов

В основе иммунологических реакций лежит специфическое взаимодействие антигена с антителом.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМЫ При определении антигена - минимальная концентрация вещества, определяемая данной тест-системой. При определении антител – процент образцов, давших положительный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, содержащих выявляемые антитела.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМЫ Процент образцов, давших отрицательный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, действительно не содержащих выявляемый маркёр.

ППЗ и ОПЗ Положительное прогнозируемое значение (ППЗ) – вероятность того, что пациент с положительным результатом анализа действительно болен (инфицирован). Отрицательное прогнозируемое значение (ОПЗ) – вероятность того, что пациент с отрицательным результатом анализа действительно здоров (не инфицирован).

ЗАВИСИМОСТЬ ППЗ И ОПЗ ОТ РАСПРОСТРАНЁННОСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Сыворотка крови

Пробирки - контейнеры для получения сыворотки крови

Варианты иммунологических реакций: Прямые, основаны на взаимодействии антигена с антителом (агглютинация, преципитация) Опосредованные реакции или непрямые, взаимодействие атнигена и антитела через посредника (реакция непрямой гемагглютинации, реакция связывания комплемента) Реакции с использованием меченых антител или антигенов (иммуноферментный, радиоиммунный анализ, метод флюоресцирующих антител).

Реакция агглютинации, варианты: Ориентировочная РА Развернутая РА Реакция Кастеллани РНГА РЛА Реакция Кумбса Ко-агглютинации

Реакция агглютинации (ориентировочная, для идентификации микроорганизма)

Развернутая реакция агглютинации

А. Кастеллани метод Кастеллани (A. Castellani, р. 1878 г., итал. врач) — метод извлечения противобактериальных антител из иммунной сыворотки крови путем их сорбции на убитых бактериях соответствующего штамма (удаление АТ, реагирующих с групповыми АГ); применяется для изучения антигенных свойств бактерий, главным образом кишечной группы, а также для изготовления моноспецифических сывороток.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) – или пассивная гемагглютинация (РПГА)

РНГА в иммунологическом планшете на выявление HBsAg.

Постановка и результат РНГА.

Тест-система для проведения РНГА

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) метод идентификации вирусов или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного. в присутствии иммунной к вирусу сыворотки крови агглютинация эритроцитов отсутствует

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) (схема).

Результаты РТГА при типировании вируса гриппа

Определение титра антител крови больного по РТГА

Реакция латекс-агглютинации (РЛА)

Реакция коагглютинации (РКА) В качестве носителя используются: Белок А S.aureus (неспецифически адсорбирует на своей поверхности Fc-фрагменты иммуноглобулина G) Белок G стрептококков Инертные носители (активированный уголь)

Схема реакции коагглютинации

Реакция Кумбса с неполными антителами (бруцеллез, резус-конфликт)

Занятие №2

Реакция преципитации Осаждение специфических мелкодисперсных антигенов эквивалентным количеством антител (в присутствии электролита) Варианты: в жидкой среде - по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации в плотной среде в агаре (геле).

Реакции преципитации: кольцепреципитации реакция флокуляции реакция преципитации в геле по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия по Манчини, реакция иммуноэлектрофореза

Реакция кольцепреципитации.

Реакция преципитации в растворе

Реакция преципитации в геле по Оухтерлони

Реакция преципитации в геле по Манчини

Реакция иммуноэлектрофореза .

Реакция иммунного лизиса: Реакция связывания комплемента (РСК)

РСК протекает в 2 фазы: РСК протекает в 2 фазы: Взаимодействие АТ, АГ и комплемента, в результате которого свободный комплемент связывается образовавшимся комплексом АГ—АТ (специфич. фаза); индикация реакции сенсибилизир. эритроцитами (неспецифич. фаза). В РСК используют 2 системы: специфич. бактериол., состоящую из АТ (испытуемой сыворотки), АГ и комплемента, а также неспецифич. “индикаторную”, содержащую гемолизин (гемолитич. сыворотка) и взвесь эритроцитов барана. АГ соединяется с АТ только в присутствии комплемента. Если испытуемая сыворотка содержит АТ, гомологичные взятому АГ, то присутствующий в реагирующей смеси комплемент адсорбируется образующимся комплексом АГ—АТ и теряет способность лизировать сенсибилизированные эритроциты, т. е. без комплемента гемолизин (гемолитич. антитело) не разрушает эритроциты (реакция положительная). В тех случаях, когда между АГ и АТ испытуемой сыворотки нет специфич. родства, комплекс не образуется и комплемент остаётся в свободном состоянии. При добавлении гемолитич. системы в этом случае несвязанный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (реакция отрицательная).

Реакция связывания комплемента

Реакция Вассермана (RW) относится к группе реакций связывания комплемента (А. Р. Wassermann, нем. бактериолог, 1866-1925) - иммунологическая реакция, применяемая в диагностике сифилиса)

Иммунофлюоресцентный метод Кунса

Иммунофлюоресцентный анализ(метод Кунса)- или реакция иммунофлюорисценции(РИФ): Прямой флюорисцирующие АТ+ исследуемый АГ Непрямой – универсальная флюорисцирующая сыворотка + специфические АТ +исследуемый АГ

Иммунофлюоресцентный анализ

Радиоиммунный анализ (РИА) твердофазный. Высоко чувствительный метод. Применяют для количественного определения различных веществ : гормонов, белков сыворотки крови, лекарственных препаратов, микробных антигенов. Изотоп – 125 I.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Схема иммуноферментного анализа твердофазный вариант

Схема иммуноферментного анализа твердофазный вариант

Конкурентный вариант ИФА для определения антигенов

Иммунологические планшеты, используемые для постановки ИФА

Автоматический биохимический и иммуноферментный анализатор