Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА )

Нажмите для полного просмотра!

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №2

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №3

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №4

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №5

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №6

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №7

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №8

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №9

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №10

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №11

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №12

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №13

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №14

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №15

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №16

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №17

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №18

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №19

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №20

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №21

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №22

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №23

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №24

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №25

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №26

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №27

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №28

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №29

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №30

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №31

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №32

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №33

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №34

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №35

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №36

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №37

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №38

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №39

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №40

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №41

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №42

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №43

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №44

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №45

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №46

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №47

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №48

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №49

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №50

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №51

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №52

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №53

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №54

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №55

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №56

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №57

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №58

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №59

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №60

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №61

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №62

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №63

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №64

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №65

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №66

Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ), слайд №67

Содержание ▲

Вы можете ознакомиться и скачать презентацию на тему Иммунохимические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА ). Доклад-сообщение содержит 67 слайдов. Презентации для любого класса можно скачать бесплатно. Если материал и наш сайт презентаций Mypresentation Вам понравились – поделитесь им с друзьями с помощью социальных кнопок и добавьте в закладки в своем браузере.

Слайды и текст этой презентации

Слайд 1

Описание слайда:

Иммунохимические методы. ИФА – иммуноферментный анализ Профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии, Д.м.н. Спирина Людмила Викторовна

Слайд 2

Описание слайда:

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Иммунохимические методы анализа основаны на специфическом связывании определяемого соединения с соответствующими антителами.

Слайд 3

Описание слайда:

Слайд 4

Описание слайда:

Индикация образующегося комплекса антиген-антитело может быть осуществлена, различными методами. 1. Радионуклид используется при радиоиммунном анализе (РИА). 2. Ферменты, катализирующие превращение бесцветного субстрата в цветной или флюоресцирующий продукт. В данном случае исследование называют иммуноферментным анализом (ИФА), его разновидность - анализ иммуноферментно-флюоресцентный. 3. Флюоресцирующие, люминесцирующие вещества и др.

Слайд 5

Описание слайда:

ИСТОРИЯ Исторически первым среди них был радиоиммунологический анализ (РИА) В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. На протяжении последних трех десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане.

Слайд 6

Описание слайда:

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Слайд 7

Описание слайда:

Классификация.

Слайд 8

Описание слайда:

Классификация.

Слайд 9

Описание слайда:

Классификация.

Слайд 10

Описание слайда:

«Твердая фазы» для ИФА пластмасса (полистирол, поливинилхлорид и др.) в виде стандартно штампованных микроплашек с 96 или 60 лунками (или шарики, колпачки и прочее - для постановки единичных проб); Белки хорошо сорбируются на подобранных для ИФА пластмассовых материалах. Все остальные реагенты тест-систем используют в виде растворов. Результат реакции «остается» на твердой фазе и регистрируется количественно.

Слайд 11

Описание слайда:

Прямой ИФА Гомогенный (EMIT-анализ) Гетерогенный 1. конкурентный 2. ингибиторный 3.Сэндвич-анализ 4.иммуномерсентометрический

Слайд 12

Описание слайда:

EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique) – способ гомогенного ИФА, основанный на связи с ферментами. В основе гомогенного ИФА лежит ингибирование активности фермента при его соединении с антигеном и восстановление ее в результате реакции антиген – антитело или же, наоборот, потеря активности фермента в результате реакции. Существенным достоинством гомогенного ИФА является экспрессность определения, которая составляет 2 – 5 минут. К недостаткам следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (~ 1 мкг/мл).

Слайд 13

Описание слайда:

Прямой конкурентный метод. К иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена.

Слайд 14

Описание слайда:

Ингибиторный ИФА

Слайд 15

Описание слайда:

Примером неконкурентного ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации образуется комплекс антиген-антитело. Добавляют меченные ферментом специфические антитела. Ферментативная реакция –при добавлении субстрата Определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

Слайд 16

Описание слайда:

Сэндвич- метод. ELISA На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, Сэндвич по крайней мере, две антигенные детерминанты.

Слайд 17

Описание слайда:

«сэндвич»-метод -пример неконкурентного ИФА «Сэндвич»-ИФА не требует препаратов очищенных антигенов, что выгодно отличает его от конкурентных и ингибиторных методик, поскольку чистые антигены всегда труднодоступны и дороги. Чувствительность «сэндвич»-ИФА потенциально выше, чем конкурентных и ингибиторных. Аналогичная технология применима и с использованием одного антитела (и на твердой фазе, и в составе конъюгата с ферментом) в случаях наличия на заданном антигене повторяющихся эпитопов. В современных модификациях ту же технологию называют ловушечным ИФА (capture IA) - антитела на твердой фазе «ловят» свой антиген из смеси веществ в биопробе.

Слайд 18

Описание слайда:

Иммунометрический анализ При иммунометрическом анализе в пробирку с испытуемой пробой, предположительно содержащей определяемый антиген, вносят заведомый избыток меченых антител. Затем к этой смеси добавляют также заведомый избыток иммобилизованного на мелкодисперсной твердой фазе антигена.

Слайд 19

Описание слайда:

Непрямой ИФА Гетерогенный 1. конкурентный 2. ингибиторный 3.Сэндвич-анализ (неконкурентный) 4.иммуномерсентометрический

Слайд 20

Описание слайда:

СХЕМА непрямого ИФА

Слайд 21

Описание слайда:

Непрямой «сэндвич»-метод Непрямые варианты ИФА не требуют очистки искомых антигенов или антител Вместо антивидовых антиглобулиновых антител для конъюгации с ферментом может быть использован, например, протеин А стафилококка, который по своей природе с высокой аффинностью связывается с иммуноглобулинами класса G некоторых видов млекопитающих, включая человека.

Слайд 22

Описание слайда:

Непрямой конкурентный ИФА.

Слайд 23

Описание слайда:

Преимущества и недостатки

Слайд 24

Описание слайда:

Ферменты- метки в ИФА Пероксидаза из корней хрена (субстраты: • орто-фенилендиамин (продукт желто-коричневый, растворимый, поглощает при 492 нм);• 3,3'-диаминобензидин (продукт коричневый, нерастворимый); • 3-амино-9-этилкарбазол (продукт красный; нерастворимый); • β-Галактозидаза (субстраты - дериваты β-галактозида, например 4-метилумбелиферил-β-D-галактозин). Щелочная фосфатаза (субстраты: 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат в комбинации с голубым тетразолиевым, продукт голубой, нерастворимый; р-нитрофенил фосфат, продукт желтый, растворимый, поглощает при 405 нм). Уреаза (субстрат - мочевина в комбинации с бромкрезолом пурпурным, продукт образуется очень быстро, пурпурного цвета, растворимый, поглощает при 590 нм).

Слайд 25

Описание слайда:

Основные типы тест-систем в зависимости от используемых антигенов

Слайд 26

Описание слайда:

«авидинбиотиновое» взаимодействие Если по тем или иным биохимическим причинам заданный антиген или интересующее антитело не удается конъюгировать с меткой без существенных потерь в аффинности их связывания, то в конструкцию тест-системы пробуют вводить дополнительные компоненты. Авидин - белок, выделяемый из «белка» куриных яиц, биотин - витамин Н (он же кофермент R). Авидин по своей природе с высокой аффинностью (Kd ~ 10-15 M) связывает биотин. Биотин легко конъюгируется с флюоресцеином. Кроме того, и против авидина, и против биотина получены высокоаффинные моноклональные антитела. Сходным по аффинности сродством к биотину обладает также белок стрептавидин, выделяемый из грибов Streptomyces avidinii.

Слайд 27

Описание слайда:

Преимущества и недостатки ИФА Преимущества метода ИФА: 1) Высокая специфичность и чувствительность метода ИФА (более 90%). 2) Возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках. 3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Слайд 28

Описание слайда:

Недостатки ИФА: влияние фона на результат анализа, наличие в тестируемых образцах модификаторов активности ферментов (кофакторов, ингибиторов); возможность денатурации ферментов под действием внешних факторов; применение метода возможно лишь к хорошо изученным системам, где есть очищенные антигены и высокоспецифичные антитела.

Слайд 29

Описание слайда:

Пути преодоления Для уменьшения вероятности получения ложноположительных результатов ИФА используют в сочетании с соответствующими хроматографическими подтверждающими методами. ВЕСТЕРН БЛОТТИНГ – подтверждающий метод для диагностики ВИЧ

Слайд 30

Описание слайда:

Применение. 1) Поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию; 2) поиск антигенов каких-либо заболеваний (инфекционных, венерологических); 3) исследование гормонального статуса пациента; 4) обследование на онкомаркеры; 5) обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

Слайд 31

Описание слайда:

РИА – радиоиммунный анализ С целью определения гормонов в крови на современном этапе применяются различные методики. Каждая методика имеет свои недостатки и преимущества и используется с максимальной эффективностью. Так, с помощью биологических методик, как правило, можно определить наличие вещества, но нельзя сделать его количественную оценку. Такую возможность дают количественные иммунохимические и неиммунохимические методы анализа.

Слайд 32

Описание слайда:

Принцип РИА Принцип, используемый в РИА, распространяется и на другие иммунохимические и неиммунохимические методы анализа - принцип конкурентного связывания. В основе РИА лежит феномен конкуренции: связывание антител с антигеном, меченным радиоактивным изотопом, подавляется в присутствии немеченого антигена.

Слайд 33

Описание слайда:

Методика РИА проста и включает следующие основные этапы: К антителам добавляют меченый антиген и пробу (содержащую неизвестное количество немеченого антигена). Реакционную смесь инкубируют при определенной температуре заданное время. Меченный и немеченый антигены конкурентно связываются с антителами, при этом образуются иммунные комплексы, содержащие либо меченный, либо немеченый антиген. Таким образом, к концу инкубации в реакционной смеси присутствуют меченные и немеченые иммунные комплексы, а также свободные меченные и немеченые антигены. Количество меченных иммунных комплексов обратно пропорционально количеству немеченого антигена в пробе. Чтобы оценить количество образовавшихся меченных иммунных комплексов, их отделяют от оставшегося несвязанным свободного меченого антигена. Определяют концентрацию антигена в пробе по калибровочной кривой. Для ее построения используют несколько стандартных калибровочных растворов с известными концентрациями немеченого антигена.

Слайд 34

Описание слайда:

Разработано множество вариантов РИА.

Слайд 35

Описание слайда:

ПРЕИМУЩЕСТВО РИА Преимуществом практически всех RIA наборов является проведение анализа без предварительного разведения анализируемых проб. Таким образом, при достаточно широком диапазоне определяемых концентраций исключается дополнительный источник

Слайд 36

Описание слайда:

РИА и влияние условий инкубации Следует также учесть, что ферментативная реакция (ИФА) сильно зависит от температуры, времени, pH, качества воды, степени попадания прямого света. Поэтому хорошие результаты с ИФА достигаются при использовании полностью автоматизированных (в большинстве закрытых) анализаторов, исключающих возможные неточности в процедуре анализа. Однако такие анализаторы очень дороги и ставят потребителя в зависимость от определенной фирмы.

Слайд 37

Описание слайда:

Стоимость и качество РИА В настоящее время, сравнивая качество, получаемых методом РИА результатов, рядом достоин стоять лишь хемилюминесцентный или флуоресцентный анализ. Главным же недостатком хемилюминесцентных систем является их ориентация на закрытые автоматические анализаторы, что, несомненно, сказывается на стоимости анализа (в среднем в 2 раза выше, чем РИА методика).

Слайд 38

Описание слайда:

по сравнению с другими биологическими и биохимическими методами РИА обладает

Слайд 39

Описание слайда:

Недостаток РИА , - НАЛИЧИЕ СПЕЦИАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ короткий срок «жизни» антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопамиограниченный периодом полураспада изотопа; высокая стоимость разового определения, обусловленная стоимостью регистрирующей аппаратуры; отсутствие полевых вариантов регистрирующей аппаратуры; усиленные меры по технике безопасности, связанные с радиационным риском для персонала; риск загрязнения окружающей среды радиоактивными продуктами.

Слайд 40

Описание слайда:

Разница между ПЦР и ИФА. ПЦР или ИФА не являются заменяемыми методами исследования ИФА-анализ основан на выявлении не самой инфекции, а ее продуктов жизнедеятельности — белов-маркеров. ПЦР-анализ напротив выявляет существующие в настоящее время инфекционные агенты (бактерии, вирусы, грибы). Случается, что результаты ПЦР и ИФА-диагностики могут не совпадать. Обычно это происходит вследствие нескольких причин: «Иммунологический след» — «след» от уже перенесенной инфекции. Разница в используемых тест-системах для проведения диагностики.

Слайд 41

Описание слайда:

Разница между ПЦР и ИФА. ПЦР или ИФА не являются заменяемыми методами исследования Разница в используемом материале. Материал для ПЦР получают из места предполагаемой локализации инфекции. Для ИФА-диагностики разницы в месте нет, поскольку ИФА «реагирует» на антитела, которые вырабатываются при инфекционном процессе любой локализации. Хронические инфекционные заболевания могут стать причиной разницы в результатах ИФА и ПЦР-диагностики. При этом зачастую ПЦР дает положительный, а ИФА — отрицательный результат. 1. Уставшая от хронического инфекционного процесса иммунная система может «не показать» повышенный уровень антител к инфекции. 2. В случае «свежей» инфекции до 2 недель. ПЦР дает положительный, а ИФА — отрицательный результат.

Слайд 42

Описание слайда:

Слайд 43

Описание слайда:

ПЦР в реальном времени. Сущность метода заключается в исследовании накопления продуктов амплификации с помощью специального прибора без последующего электрофореза. Так как кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходным количеством матрицы, это дает возможность точно оценить её количество.

Слайд 44

Описание слайда:

Преимущества Отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов.. Данная методика в ее сегодняшнем формате, благодаря экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованности количественного определения ДНК/РНК.

Слайд 45

Описание слайда:

Причины ложноположительных и ложноотрицательных результатов ИФА. за счёт ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Помимо этого, причиной ложнопололожительных результатов может быть синдром поликлональной активации. При этом, особые вещества — суперантигены — неспецифически стимулируют выработку B-лимфоцитами антител к различным инфекциям. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям.

Слайд 46

Описание слайда:

Hook effect Понятие "highdose hook effect" отражает тот факт, что при чрезмерно высоких концентрациях вещества, с которым идет реакция, результат реакции может быть неверным - показывать неправдоподобно низкий уровень.

Слайд 47

Описание слайда:

этапы анализа - Преаналитический (долабораторный) этап включает в себя все стадии от назначения анализа клиницистом до поступления исследуемого образца в лабораторию на рабочее место, а именно: назначение анализа, отбор биологического материала, его обработку и доставку в лабораторию. - Аналитический доприборный этап представляет собой все стадии ручного или полуавтоматического анализа до момента регистрации результатов. - Приборный этап обычно является стадией регистрации результатов, но может также включать все процедуры, которые происходят с пробой при проведении автоматических видов анализа. - Постаналитический этап состоит из оформления бланка с результатами, интерпретации результатов лабораторного исследования, доведения результатов до лечащего врача и постановки диагноза. На постаналитическом этапе возможным источником ошибок может являться неправильное заполнение бланка с результатами, а также неверная трактовка полученных данных.