🗊Презентация Нефелометрия, турбодиметрия

Фотометрические методы биохимического анализа Нефелометрия. Турбодиметрия

Рассеяние света Мутный раствор в кювете - поглощает свет (если окрашен) - частично проходит, не изменяя направления (трансмиссия) - частично рассеивается, изменяя направление под различными углами (рассеивание)

Рассеяние света Трансмиссия и рассеивание зависят от - длины волны светового потока - частоты светового потока - интенсивности светового потока - свойств рассеивающей среды (размера и формы частиц, количества, способности к поляризации и др) Если в процессе измерения размер частиц в растворе меняется, будет меняться поток проходящего и рассеивающего света

Определение светорассеивания Зависит от длины волны (λ) Диаметра частиц, на которых происходит рассеивание Если размер частиц значительно меньше длины волны светового потока (<λ/10) – упругое рассеяние

Интенсивность потока, рассеиваемого небольшими частицами, подчиняется уравнению Релея

В основе рассеяния малых частиц лежит явление дифракции Рассеяние света каждой частицей не зависит друг от друга. Рассеянный свет распространяется во всех направлениях Максимальное количество света рассеивается под углом 0 и 180º При λ 400нм – такой тип рассеивания характерен для частиц диаметром < 40 нм (иммуноглобулины,β- липопротеины, альбумин)

При увеличении размеров частиц (40-400 нм)рассеивание становится несимметричным Максимальное количество света рассеивается в направлении падающего луча При λ 400нм (Ig M, хиломикроны, формирующиеся комплексы антигенов с иммуноглобулинами)

При превышении длины света (диаметр > 400 нм) несимметричность светорассеяния увеличивается Характерен для взвеси бактерий, клеток крови (тромбоциты, эритроциты)

Нефелометрия Измерение рассеянного света Сравнивая величины рассеянного и падающего света можно определять концентрацию вещества в растворе

Оптическая схема нефелометра

Турбидиметрия Измерение прошедшего света Турбидиметры построены по типу фотометров

Турбидиметрия Выражение, подобное закону Бугера-Ламберта для окрашенных растворов t – молярный коэффициент мутности раствора (турбидность) В качестве турбидиметров можно использовать большинство фотометров и биохимических анализаторов Обычно используются короткие волны (340 нм), т.к. доля рассеянного света увеличивается обратно пропорционально четвертой степени длины волны – т.е. при меньшей длине волны прошедший свет будет составлять большую часть от падающего, для более короткого ультрафиолета нужна специальная оптика

Турбидиметрия и нефелометрия Используются для определения индивидуальных белков Особенность – построение калибровочного графика с использованием не менее пяти концентраций (калибровочный график имеет нелинейный характер)

Кривая доза-эффект При взаимодействии антиген-антитело образуют агрегаты

Кривая доза-эффект При пропорциональной концентрации антигенов и антител комплекс выпадает в осадок – преципитат. В супернатанте не определяются антитела и антигены – эквивалентное состояние

Кривая доза-эффект При увеличении концентрации антигенов количество антител недостаточно для полного связывания белка. Частицы иммунных комплексов становятся мелкими, преципитат не формируется. В супернатанте – свободные антигены – антиген-эксцесс

Кривая доза-эффект Классическая преципитационная кривая Хайдельберга-Кендаля

Калибровочный график Строится для -каждого индивидуального белка -каждого прибора -при любом условий регистрации -периодически при проведении исследований При серийных исследованиях в стандартных условиях допускается корректировка графика на основании измерения одного из стандартов. (вид стандартной кривой не меняется из-за влияния систематических факторов, происходит параллельный сдвиг всего графика)

Состав реакционной смеси подбирается так, чтобы измерение производилось в зоне избытка антител. При очень высокой концентрации белка антител недостаточно, частицы преципитата становятся мелкими (нисходящая часть кривой) – с увеличением концентрации белка сигнал прибора уменьшается. Может быть выдан неправильный результат. Проводят разведение биологической жидкости Если сигнал увеличивается – определение проводилось в нисходящей части кривой Разведение проводят до степени избытка антител

Современные приборы способны определять и отслеживать избыток антигенов автоматически (регистрация ускорения реакции после добавления дополнительного количества антигена –малые дозы калибратора) При постановке на обычном фотометре необходимо знать диагноз. Избыток антигена наблюдается в чрезвычайной ситуации. При миеломной болезни концентрация IgG может быть очень высокой, и исследование попадает в зону избытка антигена. Необходимо электрофоретическое исследование В качестве стандартов и контрольных материалов необходимо использовать стандарты и сыворотки, содержащие индивидуальные белки, концентрация которых измерена с использованием иммунохимической реакции

КЛИНИЧЕСКИЙ СПЕКТРОФОТОМЕТР

Кормей-мульти – программируемый фотометр с проточной кюветой

Спектр поглощения производных гемоглобина